目的检测结直肠癌(CRC)患者血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)的甲基化水平,并分析其临床应用价值。方法收集38例大连大学附属新华医院就诊的CRC患者(Ⅰ~Ⅲ期)及38例体检健康者的血液标本,采用化学发光法检测血清癌胚抗原(CEA)水平;提取...目的检测结直肠癌(CRC)患者血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)的甲基化水平,并分析其临床应用价值。方法收集38例大连大学附属新华医院就诊的CRC患者(Ⅰ~Ⅲ期)及38例体检健康者的血液标本,采用化学发光法检测血清癌胚抗原(CEA)水平;提取CRC组及体检健康者血浆cfDNA,行高通量甲基化靶向测序检测,计算甲基化评分,并分析其与CRC患者临床病理参数的关系;ROC曲线评估cfDNA和CEA单独及联合检测筛查CRC的临床价值。结果与健康人对照组相比,CRC组cfDNA浓度差异无统计学意义(34.41±5.00 vs 36.59±4.46,t=0.326,P=0.745),而cfDNA甲基化评分显著升高(0.53±0.27 vs 0.26±0.18,t=6.134,P<0.001)。伴有淋巴结转移的CRC患者cfDNA甲基化阳性率较无淋巴结转移者显著升高(88.9%vs 60%,χ^(2)=4.323,P=0.038),但在不同性别、年龄、肿瘤位置分组中的差异均无统计学意义(P均>0.05)。ROC曲线分析结果显示,cfDNA甲基化检测筛查CRC的ROC曲线下面积(AUC_(ROC))为0.892(95%CI:0.814~0.970),血清CEA为0.810(95%CI:0.707~0.909),二者联合检测的AUC_(ROC)为0.930(95%CI:0.8674~0.9967)。cfDNA甲基化检测的敏感性为84.21%,特异性为86.84%(cut-off值为0.2805);CEA单独检测的敏感性为42.1%,特异性为97.3%(cut-off值为4.0 ng/mL);二者联合检测的敏感性显著升高(89.47%),特异性为91.89%,准确性为90.67%。结论血浆cfDNA甲基化检测在CRC筛查中的敏感性和特异性较高,并且与淋巴结转移相关,具有较好的临床应用价值。展开更多
目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联...目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况。结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为1.79%、93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05)。在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P<0.05),mRNA表达无变化。结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默。该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点。展开更多
目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方...目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方法的检测限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)及稳定性方面进行比较,其中稳定性用变异系数(coefficient of variation,CV)来评估。结果 SFRP2基因在Methy Light、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOD分别为1.2500ng/孔、0.0625ng/孔、0.0625ng/孔、1.2500ng/孔,在LOD方面,ddPCR和核酸质谱的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOQ分别为0.800%、0.032%、4.000%、0.032%,在LOQ方面,ddPCR和靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的变异系数分别为2.72%、0.68%、0.73%、0.15%,在稳定性方面,靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现最好。结论 ddPCR的甲基化检测在检测限、定量限稳定性和经济性方面具有优越性,能够稳定地检测出肿瘤细胞的痕量游离DNA,在液态活检中具有广泛应用前景。展开更多
目的探讨ID4、ZO-1基因甲基化定量检测作为基因标志在急性白血病（acute leukemia，AL）中的意义。方法采用硫化测序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）法及甲基化特异性PCR（methylightion specific PCR，MSP）法检测AL中NB4细胞和...目的探讨ID4、ZO-1基因甲基化定量检测作为基因标志在急性白血病（acute leukemia，AL）中的意义。方法采用硫化测序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）法及甲基化特异性PCR（methylightion specific PCR，MSP）法检测AL中NB4细胞和健康供者骨髓（normal bone marrow，NBM）细胞的ID4、ZO-1基因的甲基化状况并进行分析。结果BSP法检测ID4基因在ALNB4细胞中甲基化阳性率为86．0％，显著高于NBM细胞甲基化阳性率（4．8％），差异有统计学意义（P〈0．05）；ZO-1基因在ALNB4细胞系中甲基化阳性率为88．4％，显著高于NBM细胞甲基化阳性率（1．9％），差异有统计学意义（PP〈0．05）。采用MsP法检测9种AL细胞系，ID4、ZO-1基因甲基化水平在淋系来源的细胞系高于髓系来源的细胞系。结论ID4、ZO-1基因甲基化水平检测可作为新的AL基因标志物。展开更多
目的:探讨新发现的抑癌基因SRY盒包含基因30(SOX30)在结直肠癌中的表达及甲基化变化。方法:用逆转录PCR(RTPCR)检测结直肠癌细胞株(HCT8、HCT116和SW480)中SOX30 m RNA的表达,利用去甲基化药物5-Aza-Cd R处理结直肠癌细胞株72h后检测SO...目的:探讨新发现的抑癌基因SRY盒包含基因30(SOX30)在结直肠癌中的表达及甲基化变化。方法:用逆转录PCR(RTPCR)检测结直肠癌细胞株(HCT8、HCT116和SW480)中SOX30 m RNA的表达,利用去甲基化药物5-Aza-Cd R处理结直肠癌细胞株72h后检测SOX30基因高甲基化与其表达调控的关系。应用甲基化特异性PCR(MSP)检测上述3株结直肠癌细胞株及54例结直肠肿瘤组织和10例癌旁组织SOX30基因的甲基化发生情况,通过硫化测序PCR(BSP)验证结直肠癌组织和癌旁组织SOX30基因的甲基化改变,并对甲基化情况与结直肠癌患者病理特征进行相关性分析。结果:SOX30 m RNA在上述3株结直肠癌细胞株中表达与对照组相比均较低,且均发生明显高甲基化;去甲基化药物处理上述3株细胞株后,SOX30 m RNA的表达明显得到恢复。SOX30基因在大部分结直肠癌组织中均呈现高甲基化状态,甲基化发生率为79.6%(43/54);而在相应的癌旁组织中甲基化检出率较低,仅为20%(2/10)。对结直肠癌患者中SOX30基因甲基化与其临床病理学资料进行相关性分析发现,SOX30基因高甲基化与患者的肿瘤病理分型显著相关(P=0.045),而与患者的性别、年龄、吸烟与否、TNM分期和Ducks分期无显著相关性(P均>0.05)。结论:SOX30基因在结直肠癌中发生明显高甲基化修饰改变,其基因表达水平明显下调,而且其甲基化修饰率与患者肿瘤病理分型相关,提示SOX30可能在结直肠癌的发生过程中起重要作用。展开更多
文摘为建立一种高同源区段的单核苷酸多态性(SNP)基因分型技术,通过构建本地Blast对SNP所在的200和400 bp区段进行同源性评估,并筛选出高同源区段的SNP。利用第一轮多重长PCR(polymerase chain reaction)捕获329个样本的9个高同源区段SNP所在的长片段,使用纯化后的第一轮PCR产物作为模板进行扩增子建库测序,检测样本共得2 928个SNP位点信息,测序成功率高达98.885 6%。利用Hardy-Weinberg(HWE)法则计算试验研究的9个高同源区段SNP位点的基因频率(p值均大于0.05,符合HWE法则),并与NCBI(national center for biotechnology information)中千人基因组数据库中获取的基因频率相比对,发现二者单碱基基因频率一致(误差限<0.15)。研究表明,利用多重长PCR靶向捕获技术结合二代测序技术为高同源区段的SNP分型提供一个准确、快速、大样本检测方案。
文摘目的检测结直肠癌(CRC)患者血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)的甲基化水平,并分析其临床应用价值。方法收集38例大连大学附属新华医院就诊的CRC患者(Ⅰ~Ⅲ期)及38例体检健康者的血液标本,采用化学发光法检测血清癌胚抗原(CEA)水平;提取CRC组及体检健康者血浆cfDNA,行高通量甲基化靶向测序检测,计算甲基化评分,并分析其与CRC患者临床病理参数的关系;ROC曲线评估cfDNA和CEA单独及联合检测筛查CRC的临床价值。结果与健康人对照组相比,CRC组cfDNA浓度差异无统计学意义(34.41±5.00 vs 36.59±4.46,t=0.326,P=0.745),而cfDNA甲基化评分显著升高(0.53±0.27 vs 0.26±0.18,t=6.134,P<0.001)。伴有淋巴结转移的CRC患者cfDNA甲基化阳性率较无淋巴结转移者显著升高(88.9%vs 60%,χ^(2)=4.323,P=0.038),但在不同性别、年龄、肿瘤位置分组中的差异均无统计学意义(P均>0.05)。ROC曲线分析结果显示,cfDNA甲基化检测筛查CRC的ROC曲线下面积(AUC_(ROC))为0.892(95%CI:0.814~0.970),血清CEA为0.810(95%CI:0.707~0.909),二者联合检测的AUC_(ROC)为0.930(95%CI:0.8674~0.9967)。cfDNA甲基化检测的敏感性为84.21%,特异性为86.84%(cut-off值为0.2805);CEA单独检测的敏感性为42.1%,特异性为97.3%(cut-off值为4.0 ng/mL);二者联合检测的敏感性显著升高(89.47%),特异性为91.89%,准确性为90.67%。结论血浆cfDNA甲基化检测在CRC筛查中的敏感性和特异性较高,并且与淋巴结转移相关,具有较好的临床应用价值。
文摘目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用。方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A的mRNA表达情况。结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为1.79%、93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05)。在PANC-1细胞、胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P<0.05),mRNA表达无变化。结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织、癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默。该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点。
文摘目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方法的检测限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)及稳定性方面进行比较,其中稳定性用变异系数(coefficient of variation,CV)来评估。结果 SFRP2基因在Methy Light、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOD分别为1.2500ng/孔、0.0625ng/孔、0.0625ng/孔、1.2500ng/孔,在LOD方面,ddPCR和核酸质谱的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOQ分别为0.800%、0.032%、4.000%、0.032%,在LOQ方面,ddPCR和靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的变异系数分别为2.72%、0.68%、0.73%、0.15%,在稳定性方面,靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现最好。结论 ddPCR的甲基化检测在检测限、定量限稳定性和经济性方面具有优越性,能够稳定地检测出肿瘤细胞的痕量游离DNA,在液态活检中具有广泛应用前景。
文摘目的探讨ID4、ZO-1基因甲基化定量检测作为基因标志在急性白血病（acute leukemia，AL）中的意义。方法采用硫化测序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）法及甲基化特异性PCR（methylightion specific PCR，MSP）法检测AL中NB4细胞和健康供者骨髓（normal bone marrow，NBM）细胞的ID4、ZO-1基因的甲基化状况并进行分析。结果BSP法检测ID4基因在ALNB4细胞中甲基化阳性率为86．0％，显著高于NBM细胞甲基化阳性率（4．8％），差异有统计学意义（P〈0．05）；ZO-1基因在ALNB4细胞系中甲基化阳性率为88．4％，显著高于NBM细胞甲基化阳性率（1．9％），差异有统计学意义（PP〈0．05）。采用MsP法检测9种AL细胞系，ID4、ZO-1基因甲基化水平在淋系来源的细胞系高于髓系来源的细胞系。结论ID4、ZO-1基因甲基化水平检测可作为新的AL基因标志物。
文摘目的:探讨新发现的抑癌基因SRY盒包含基因30(SOX30)在结直肠癌中的表达及甲基化变化。方法:用逆转录PCR(RTPCR)检测结直肠癌细胞株(HCT8、HCT116和SW480)中SOX30 m RNA的表达,利用去甲基化药物5-Aza-Cd R处理结直肠癌细胞株72h后检测SOX30基因高甲基化与其表达调控的关系。应用甲基化特异性PCR(MSP)检测上述3株结直肠癌细胞株及54例结直肠肿瘤组织和10例癌旁组织SOX30基因的甲基化发生情况,通过硫化测序PCR(BSP)验证结直肠癌组织和癌旁组织SOX30基因的甲基化改变,并对甲基化情况与结直肠癌患者病理特征进行相关性分析。结果:SOX30 m RNA在上述3株结直肠癌细胞株中表达与对照组相比均较低,且均发生明显高甲基化;去甲基化药物处理上述3株细胞株后,SOX30 m RNA的表达明显得到恢复。SOX30基因在大部分结直肠癌组织中均呈现高甲基化状态,甲基化发生率为79.6%(43/54);而在相应的癌旁组织中甲基化检出率较低,仅为20%(2/10)。对结直肠癌患者中SOX30基因甲基化与其临床病理学资料进行相关性分析发现,SOX30基因高甲基化与患者的肿瘤病理分型显著相关(P=0.045),而与患者的性别、年龄、吸烟与否、TNM分期和Ducks分期无显著相关性(P均>0.05)。结论:SOX30基因在结直肠癌中发生明显高甲基化修饰改变,其基因表达水平明显下调,而且其甲基化修饰率与患者肿瘤病理分型相关,提示SOX30可能在结直肠癌的发生过程中起重要作用。
