婴幼儿腹泻常见病毒多重RT—PCR检测技术的建立

目的建立病毒性腹泻婴幼儿粪便标本中同时检测轮状病毒、诺瓦克病毒、星状病毒的多重RT—PCR方法。方法对建立的多重RT—PCR法进行灵敏度、特异度、重复性分析，并应用该方法时167份疑似病毒性腹泻标本进行轮状病毒、诺瓦克病毒和星状病毒核酸检测，同时用普通RT—PCR方法、肢体金和基因序列法分析进行检测结果验证。结果167份标本中，轮状病毒、诺瓦克病毒、星状病毒阳性率分别为53．89％（90／167），17．37％（29／167），4．19％（7／167），多重RT-PCR检测结果与单一RT—PCR检测结果符合率达100％。结论实验证明，同时检测轮状病毒、诺瓦克病毒、星状病毒的多重RT—PCR法具有简便、快速、高效、准确度高、特异度强的优点，是理想的病原体检测方法，可应用于临床诊断，前景广阔。

多重RT—PCR技术检测儿童呼吸道标本中的常见病毒

目的建立多重RT—PCR技术检测儿科呼吸道标本中常见病毒的方法。方法参照病毒核酸序列设计多重RT—PCR引物，并检索NCBI数据库初步验证其特异性，以实验室阳性株验证引物特异性，优化多重RT—PCR反应条件。并对2008年61份儿童呼吸道标本进行检测，阳性片段测序验证扩增片段特异性。结果采用多重RT—PCR引物对流感病毒A型（IVA）、流感病毒B型（IVB）、副流感病毒1型（PIVl）、副流感病毒3型（PIV3）、呼吸道合胞病毒（RSV）和鼻病毒（RHV）等6种病毒进行扩增，均无非特异性扩增条带，分剐获得171，489，307，585，155，501bp片段，与设计相符；对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果，61份儿童呼吸道标本多重RT—PCR扩增，阳性率为50．82％（31／61），核酸序列与经NCBI数据库Blast比对同源性高。结论实验证明，所建立的多重RT—PCR技术检测儿童呼吸道标本中常见病毒的方法，敏感度、特异度和可重复性均较好，为常见呼吸道病毒检测提供了一种方便易行的方法。

百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)、百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657bp(CMV)、428bp(LMoV)、171bp(LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV三种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法，【方法】以携带苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）和苹果茎痘病毒（ASPV）的成龄苹果树韧皮部为试材，根据基因库中苹果茎痘病毒（Apple stempitting virus，ASPV）的外壳蛋白基因序列，设计合成了2对特异性引物，分别与合成的苹果茎沟病毒（ASGV）引物和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）的引物组合配伍，筛选出最佳的引物对组合。对eDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化，对PCR过程中eDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明，反转录引物为Oligo（dT）18、总RNA0．1～3．0μL时，可以得到较好的eDNA；ASPV—FR与ASGV—Pch、ACLSV—Pch引物组合优于ASPV—Pch，并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合；eDNA用量为2．0-4．0μL、退火温度为50．0～52．9℃、循环数为35时，扩增效果较好。采用优化的多重RT—PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测，并用3种病毒的单重RT—PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性，充分印证了该多重RT—PCR体系的准确性，适用于大量样品的快速检测。

柑橘衰退病、裂皮病和碎叶病的多重RT-PCR检测方法研究

本研究以广东省农业科学院果树研究所隔离网室内通过嫁接分别感染CTV、CEVd和CTLV的柑橘树皮为实验材料,建立了以oligo(dT)为反转录引物的RT-PCR检测体系,成功检测到在病毒RNA 3′末端带有ploy_(A)加尾的CTV和CTLV。实验过程中,发现不具有ploy_(A)加尾的环状类病毒CEVd,同样可以用oligo(dT)反转录的RT-PCR检测出来,通过测序分析,其同源性在96%以上,并发现在CEVd序列中有一个富含A的区段。在此基础上,进一步研究了同时检测CTV、CEVd和CTLV的多重RT-PCR检测体系,该方法能为这3种病害的检测简化步骤、节省时间、降低成本。

多重RT-PCR检测猪流感病毒及血清亚型

根据GenBank登录的猪流感病毒各血清亚型NP基因,H1、H3亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因核苷酸序列,经DNAstar软件类比选择保守区设计引物,sPCR筛选出引物对,用于扩增猪流感病毒NP基因、血凝素H1/H3亚型、神经氨酸酶N1/N2亚型基因片段。根据NP、H1N1、H3N2亚型引物扩增片段大小和反应条件的差异,将各引物配比组合,形成引物组合,建立多重RT-PCR体系。经对不同亚型模板的扩增、检验,建立的2个多重RT-PCR体系可用于猪流感病毒及H1/H3血凝素亚型、N1/N2神经氨酸酶亚型的快速鉴别、诊断。特异性试验检测多重RT-PCR不能扩增其他猪病毒核酸,核酸的最低检测量达0.2ng。采集临床具有呼吸道症状的猪肺、鼻腔棉试子等85份,与鸡胚分离及血凝/血凝抑制试验比较,阴性样品检测符合率达100%。

鸭新城疫病毒和流感病毒多重RT-PCR鉴别诊断技术的建立和应用

对同样以引起鸭产蛋下降为主要特征的鸭流感病毒(AIV)分离株和鸭新城疫病毒(NDV)YH99V分离株,通过设计特异性引物和优化体系反应条件,建立了一种早期快速鉴别诊断鸭AIV和鸭NDV的单项RT-PCR方法和多重RT-PCR方法,AIV的扩增片段大小为483bp,NDV的扩增片段为310bp,电泳快速,易于区分。敏感性试验表明,该方法比HA敏感100倍以上;对AIV、YH99V、IBV、IBDV及正常鸡胚尿囊液的混合液检测显示,多重RT-PCR法具有很强的特异性。对鸭病毒性产蛋下降征侯群送检病料的检测证明,该方法能有效鉴别AIV和/或NDV单独感染或混合感染,阳性检出率明显高于HA方法。

禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立

根据禽流感病毒(A IV)核蛋白(NP)和血凝素(HA)基因序列,设计1对用来鉴定A型A IV特异性引物(NP-F,NP-R)和2对用来鉴定A IV H 5和H 9不同亚型特异性引物(H 5-F,H 5-R;H 9-F,H 9-R),建立了多重RT-PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带,分别为型(NP:330 bp)和亚型(H 5A:550 bp,或H 9A:490 bp)。通过对105份样品进行检测,并与病毒分离及琼脂扩散(AGP)血清学方法作平行对比,两者之间符合率达100%;试验灵敏度为102ELD50。结果表明,建立的多重RT-PCR为检测H 5、H 9亚型A IV提供了一种快速、经济、易行的技术。

马流感病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据马流感病毒的M基因和HA基因的保守序列,设计了两对引物,MF和MR为通用引物,可以检测出H3N8和H7N7亚型EIV,目的片段227bp,HF和HR为H3N8亚型特异性引物,目的片段595bp。利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了快速检测鉴别H3N8亚型EIV的多重RT-PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术可以用于EIV的快速诊断和亚型鉴定。

同步检测为害非洲菊3种病毒的多重RT-PCR方法研究

以接种番茄斑萎病毒(TSWV)的烟草和侵染烟草脆裂病毒(TRV)及烟草花叶病毒(TMV)的非洲菊为试验材料,建立了同步检测非洲菊上述3种病毒的多重RT-PCR方法。结果表明,建立的多重RT-PCR方法可一次性扩增出3种病毒的DNA条带,可以从RNA含量1 mg的带毒叶片中检测到混合病毒;同时对单一病毒RT-PCR的灵敏度检测表明:最低可以从RNA含量分别为1 mg、10μg和100ng的带毒材料中检测到TSWV、TRV和TMV。

3种苹果潜隐性病毒一步多重RT-PCR检测体系的优化

为建立更为快速准确的苹果潜隐性病毒检测方法,以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的田间苹果成龄树为试材,设计合成了扩增目的片段为273bp(ASGV)、358bp(ACLSV)和432bp(ASPV)的3对特异性引物,并对影响RT-PCR体系的主要参数进行试验优化。结果表明:建立的一步多重RT-PCR体系可以实现对3种主要潜隐性病毒的特异性检测;通过对田间多个样品的检测验证,表明该方法的准确性和灵敏度都很高,并缩短了单个样品的检测时间,极大地提高了工作效率。

CSFV和PRRSV多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和高致病性株(HP-PRRSV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV经典株、HP-PRRSV株和CSFV基因组全序列,分别设计了2对特异性引物PRRSV-S/PRRSV-A和CSFV-S/CSFV-A,产物分别为544 bp、457 bp和294 bp。检测结果显示,该方法具有高特异性,均可检测到1 TCID50的病毒量。对65份临床上疑似为CSFV和PRRSV感染的病料样品进行检测的结果表明,本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于临床上CSFV和PRRSV感染引起的传染病病原学的检测,并且能够准确鉴别PRRSV经典株及HP-PRRSV。

禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

PCR技术是分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。然而,找到一对合适的核苷酸片段作为引物,使其有效地扩增模板DNA序列,决定着PCR的成败。在GENEBANK中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析它们的同源性,利用Primer Premier5.0软件进行引物设计。多重RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果显示引物设计成功。

肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立针对肠道病毒(enterovirus,EV)、乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和腮腺炎病毒(mumps virus,MUV)的多重RT-PCR检测方法,分别选择肠道病毒的5′UTR基因、乙脑病毒的E基因和腮腺炎病毒M基因设计3对引物,建立同时检测肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR方法.以中国地区流行的与脑炎相关的麻疹病毒和风疹病毒cDNA为模板验证该检测方法的特异性,同时以梯度稀释的不同滴度的脊髓灰质炎病毒、乙脑病毒、腮腺炎病毒评估该检测方法的检出限.所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒的152 bp、429 bp和274 bp基因片段,基因序列分别与脊髓灰质炎病毒Sabin 1型5′UTR基因片段、乙型脑炎病毒SA-14-14-2株E基因片段及腮腺炎病毒S79基因片段序列一致;检出限分别达到78.1 CCID50/mL、312.5 PFU/mL、156.2 CCID50/mL;而对麻疹病毒和风疹病毒的扩增均为阴性.所建立的多重RT-PCR特异性和检出限良好,可用于上述3种脑炎病毒的快速检测.

应用多重RT-PCR检测烟草上的TMV和CMV

根据烟草花叶病毒(TMV)复制酶蛋白和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行多重PCR反应。可以扩增出1.44 kb带和735 bp带,与预期结果完全一致。而健康对照则无任何扩增条带出现。对2005年从广东采集的18份检测样品进行检测,检测出TMV、CMV复合侵染的样本占总样品的44.44%。

人副流感病毒HPIV多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立快速检测人副流感病毒的多重PCR方法。方法通过查阅文献获取副流感病毒的PCR引物序列,并利用分子生物学软件对其进行评估,同时设计合成半巢式PCR引物。提取分离病毒的总RNA,以RNA抽提物为模板,一步法一次反转录扩增HPIV-1,2,3,4等4种型别的副流感病毒。以多重RT-PCR产物作为模板,用半巢式PCR进一步扩增确认。结果利用多重RT-PCR方法一次扩增出人副流感病毒的4个不同型别,条带大小分别是317、507、189和451bp,与目的片段大小一致;半巢式PCR扩增出相应的特异条带,条带大小分别是261、340、145和390bp,扩增结果与目的片段大小一致。结论人副流感病毒多重RT-PCR快速检测方法已初步建立。

应用多重巢式RT-PCR检测骨髓增生异常综合征中MLL基因相关的10种融合基因

本研究探讨应用多重巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨髓增生异常综合征MDS)患者MLL基因相关的融合基因的临床价值。采用多重巢式RT-PCR方法检测了221例MDS患者10种MLL基因相关融合基因(dupMLL、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-CBP、MLL-AF1P、MLL-AF1Q)。结果表明:在221例MDS患者中检测出以上融合基因者20例(9.05%),以上10种基因的阳性例数及阳性率分别依次为7(3.16%)、2(0.9%)、1(0.45%)、1(0.45%)、2(0.9%)、2(0.9%)、1(0.45%)、2(0.9%)、1(0.45%)、1(10.45%)。结论:多重巢式RT-PCR技术能同时检测MDS患者中的10种融合基因,可作为MDS诊断及疗效判定的重要依据,同时也为微小残留病(MRD)及预后提供相关的重要信息。

多重RT-PCR区分PRRSV变异株和经典株方法的建立

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株基因序列,设计合成了2对引物,分别扩增NSP2和N SP 9部分基因片段,建立了一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。该方法扩增PRRSV变异株时可获得380 bp的特异性片段,扩增PRRSV经典株时则获得380 bp和680 bp两条特异性片段,根据RT-PCR产物可将两者区分开来。试验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点,是一种快速准确检测PRRSV的方法。

葫芦科作物3种主要病毒的多重RT-PCR方法的建立

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是危害葫芦科作物最严重、最广泛的3种病毒。研究建立了以18SrRNA为内标检测ZYMV、CMV和WMV侵染葫芦科作物3种主要病毒的多重RT-PCR方法,并对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq聚合酶浓度、dNTPs浓度和镁离子浓度4种主要因素进行优化;对多重RT-PCR的灵敏性进行了测定,并与单重RT-PCR灵敏性进行比较。结果表明:最佳的退火温度、Taq聚合酶量、dNTPs浓度和Mg2+浓度分别为60.7℃、1.0U、0.8mmol/L和2.5mmol/L。多重RT-PCR各病毒的灵敏度与单重RT-PCR相同。

H_5、H_9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的多重RT-PCR检测

根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。