广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立

【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类,建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法,提高蒲瓜病毒种类鉴定效率,为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间,从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份,对采集的样品按照地区和症状进行分类,提取每份样品的总RNA,将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果,设计特异引物进行RT-PCR验证,从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒,根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物,通过优化反应体系和反应条件,建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中,共检测到12种病毒,按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒(Lagenaria sicerariaalphaendornavirus,LSEV)(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒(zucchini tigre mosaic virus,ZTMV)(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒(watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV)(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒(cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)(3.8%)、甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus,MYSV)(1.3%)。78份样品中,复合侵染率高达80.8%,其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物,12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物,引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL,从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种,其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒;复合侵染现象较普遍,以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高;研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术,提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。

水禽4种常见致病菌多重PCR方法的建立及应用

为建立一种能同时检测大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,试验根据大肠杆菌phoA基因、鸭疫里默氏杆菌ompA基因、多杀性巴氏杆菌kmt 1基因、金黄色葡萄球菌FemB基因的保守区域设计4对特异性引物,通过优化退火温度和引物浓度建立多重PCR方法,检验该方法的特异性、敏感性性、重复性,应用该方法检测145份病死水禽临床样品,并与传统细菌分离鉴定方法进行比较。结果表明:优化后的最佳退火温度为52℃,引物浓度为10μmol/L。建立的多重PCR方法能特异性地扩增出靶基因,沙门氏菌、链球菌、产气荚膜梭菌等临床常见菌均未扩增出条带,对大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌4种细菌的检出下限是0.4 pg/mL,单一PCR扩增ompA、kmt 1、phoA和FemB基因的检出下限分别为4×10^(-3),0.4,4×10^(-3),4×10^(-6)pg/mL。多重PCR方法对临床样品的检测结果与传统细菌分离鉴定方法的符合率均在90%以上。说明试验建立的多重PCR方法具有结果稳定、重复性高的特点,适合水禽病原微生物流行病学调查。

致犊牛腹泻大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立

以大肠杆菌4种毒力因子EAST1、FimH、F17、STX1为模板设计特异性引物并优化各项反应条件,建立犊牛腹泻的多重PCR检测方法,利用所建立的多重PCR方法对湖北省某牛场采集的15个样本进行检测。结果表明,在该牛场中携带FimH毒力基因的阳性菌株引起的大肠杆菌广泛存在,携带F17毒力基因的阳性菌株次之,并存在2种毒力基因混合感染的现象。综上所述,该方法的建立为大肠杆菌中常见毒力因子的快速检测及分子流行病学调查提供了新手段。

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1TCID50/mL和1TCID50/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。

禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立

根据禽流感病毒(A IV)核蛋白(NP)和血凝素(HA)基因序列,设计1对用来鉴定A型A IV特异性引物(NP-F,NP-R)和2对用来鉴定A IV H 5和H 9不同亚型特异性引物(H 5-F,H 5-R;H 9-F,H 9-R),建立了多重RT-PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带,分别为型(NP:330 bp)和亚型(H 5A:550 bp,或H 9A:490 bp)。通过对105份样品进行检测,并与病毒分离及琼脂扩散(AGP)血清学方法作平行对比,两者之间符合率达100%;试验灵敏度为102ELD50。结果表明,建立的多重RT-PCR为检测H 5、H 9亚型A IV提供了一种快速、经济、易行的技术。

马流感病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据马流感病毒的M基因和HA基因的保守序列,设计了两对引物,MF和MR为通用引物,可以检测出H3N8和H7N7亚型EIV,目的片段227bp,HF和HR为H3N8亚型特异性引物,目的片段595bp。利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了快速检测鉴别H3N8亚型EIV的多重RT-PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术可以用于EIV的快速诊断和亚型鉴定。

柑橘衰退病、裂皮病和碎叶病的多重RT-PCR检测方法研究

本研究以广东省农业科学院果树研究所隔离网室内通过嫁接分别感染CTV、CEVd和CTLV的柑橘树皮为实验材料,建立了以oligo(dT)为反转录引物的RT-PCR检测体系,成功检测到在病毒RNA 3′末端带有ploy_(A)加尾的CTV和CTLV。实验过程中,发现不具有ploy_(A)加尾的环状类病毒CEVd,同样可以用oligo(dT)反转录的RT-PCR检测出来,通过测序分析,其同源性在96%以上,并发现在CEVd序列中有一个富含A的区段。在此基础上,进一步研究了同时检测CTV、CEVd和CTLV的多重RT-PCR检测体系,该方法能为这3种病害的检测简化步骤、节省时间、降低成本。

CSFV和PRRSV多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和高致病性株(HP-PRRSV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PRRSV经典株、HP-PRRSV株和CSFV基因组全序列,分别设计了2对特异性引物PRRSV-S/PRRSV-A和CSFV-S/CSFV-A,产物分别为544 bp、457 bp和294 bp。检测结果显示,该方法具有高特异性,均可检测到1 TCID50的病毒量。对65份临床上疑似为CSFV和PRRSV感染的病料样品进行检测的结果表明,本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于临床上CSFV和PRRSV感染引起的传染病病原学的检测,并且能够准确鉴别PRRSV经典株及HP-PRRSV。

同步检测为害非洲菊3种病毒的多重RT-PCR方法研究

以接种番茄斑萎病毒(TSWV)的烟草和侵染烟草脆裂病毒(TRV)及烟草花叶病毒(TMV)的非洲菊为试验材料,建立了同步检测非洲菊上述3种病毒的多重RT-PCR方法。结果表明,建立的多重RT-PCR方法可一次性扩增出3种病毒的DNA条带,可以从RNA含量1 mg的带毒叶片中检测到混合病毒;同时对单一病毒RT-PCR的灵敏度检测表明:最低可以从RNA含量分别为1 mg、10μg和100ng的带毒材料中检测到TSWV、TRV和TMV。

同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、变异株及弱毒活疫苗TJM-F92株的基因序列差异,设计了2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪其他常见病毒无交叉反应;经典株、变异株、TJM-F92疫苗株重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。此外,该方法对324份疑似PPRSV感染的临床样品进行检测,结果显示PRRSV阳性114份,其中美洲型变异株105份、经典株6份、TJM-F92疫苗株3份,变异株和经典株混合感染4份。本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可以为PRRSV美洲型野毒株、疫苗株的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。

肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立针对肠道病毒(enterovirus,EV)、乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和腮腺炎病毒(mumps virus,MUV)的多重RT-PCR检测方法,分别选择肠道病毒的5′UTR基因、乙脑病毒的E基因和腮腺炎病毒M基因设计3对引物,建立同时检测肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR方法.以中国地区流行的与脑炎相关的麻疹病毒和风疹病毒cDNA为模板验证该检测方法的特异性,同时以梯度稀释的不同滴度的脊髓灰质炎病毒、乙脑病毒、腮腺炎病毒评估该检测方法的检出限.所建立的3种病毒的多重RT-PCR方法可同时或分别特异扩增肠道病毒、乙脑病毒和腮腺炎病毒的152 bp、429 bp和274 bp基因片段,基因序列分别与脊髓灰质炎病毒Sabin 1型5′UTR基因片段、乙型脑炎病毒SA-14-14-2株E基因片段及腮腺炎病毒S79基因片段序列一致;检出限分别达到78.1 CCID50/mL、312.5 PFU/mL、156.2 CCID50/mL;而对麻疹病毒和风疹病毒的扩增均为阴性.所建立的多重RT-PCR特异性和检出限良好,可用于上述3种脑炎病毒的快速检测.

人副流感病毒HPIV多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立快速检测人副流感病毒的多重PCR方法。方法通过查阅文献获取副流感病毒的PCR引物序列,并利用分子生物学软件对其进行评估,同时设计合成半巢式PCR引物。提取分离病毒的总RNA,以RNA抽提物为模板,一步法一次反转录扩增HPIV-1,2,3,4等4种型别的副流感病毒。以多重RT-PCR产物作为模板,用半巢式PCR进一步扩增确认。结果利用多重RT-PCR方法一次扩增出人副流感病毒的4个不同型别,条带大小分别是317、507、189和451bp,与目的片段大小一致;半巢式PCR扩增出相应的特异条带,条带大小分别是261、340、145和390bp,扩增结果与目的片段大小一致。结论人副流感病毒多重RT-PCR快速检测方法已初步建立。

多重荧光PCR方法与血清凝集方法对沙门氏菌分型鉴定的结果对比

目的 探讨多重荧光PCR方法和血清凝集方法在沙门氏菌分型鉴定结果中的意义。方法 选取扬州市邗江区疾病预防控制中心在2022年9月—2023年6月接诊的4940例进行门诊健康证筛查的患者,上述患者均接受血清凝集方法以及多重荧光PCR方法进行检测,探究两种检测方式在沙门氏菌中的检出率以及沙门氏菌分型鉴定结果。结果 多重荧光PCR方法检出效能与血清凝集方法检出效能间无统计学意义(P>0.05);在沙门氏菌分型鉴定结果中对比,多重荧光PCR鉴定方法所检测出的沙门氏菌分型中,肠炎沙门氏菌(1株),鼠伤寒沙门氏菌(1株),B群沙门氏菌(3株)较血清凝集鉴定方法检出率高,但组间对无统计学意义(P>0.05)。结论 多重荧光PCR方法和血清凝集方法在沙门氏菌检测和分型鉴定中各有优势,在特定的应用场景下可以选择适合的方法来提高检测效率和准确性,但本研究存在一定的局限性、年限短、样本量少,今后可加大样本量进一步研究。

TGEV和PEDV多重RT-PCR检测方法的建立

传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的传染性胃肠炎（TGE）是猪的一种急性、高度接触性，以呕吐、严重腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死性为主要特征的肠道传染病。TGEV与猪流行性腹泻病毒（PEDV）同属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属成员，PEDV可引起猪流行性腹泻。不同年龄和不同品种的猪对该病都易感，研究一种快速、敏感、特异、

实验动物三种条件致病菌多重分子检测方法的建立

目的建立金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌三种条件性致病菌的多重荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法选取金黄色葡萄球菌nuc基因、肺炎克雷伯杆菌phoE基因、绿脓假单胞菌gyrB基因设计特异性引物及探针,建立多重qPCR方法,并测试其特异性、灵敏度、标准曲线及重复性等性能指标。用该方法检测30个临床粪便样品、6个阳性参考品,检测结果与分离培养法结果进行对比,计算符合率。结果多重qPCR检测方法对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌的标准菌株基因组DNA均能稳定检出;对鼠伤寒沙门菌、嗜肺巴斯德杆菌、鼠棒状杆菌、支气管鲍特杆菌等病原微生物项目无非特异性扩增;针对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌标准菌株基因组DNA的灵敏度分别为1.0×10^(-5)、1.0×10^(-4)、1.0×10^(-5)ng/μL;批间差异、批内差异均小于2%,重复性良好;临床样品和阳性参考品的检测结果显示多重qPCR法与分离培养法的检测结果一致。结论本研究成功建立了一种可同时、快速检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、绿脓假单胞菌的多重qPCR检测方法。

葫芦科作物3种主要病毒的多重RT-PCR方法的建立

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是危害葫芦科作物最严重、最广泛的3种病毒。研究建立了以18SrRNA为内标检测ZYMV、CMV和WMV侵染葫芦科作物3种主要病毒的多重RT-PCR方法,并对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq聚合酶浓度、dNTPs浓度和镁离子浓度4种主要因素进行优化;对多重RT-PCR的灵敏性进行了测定,并与单重RT-PCR灵敏性进行比较。结果表明:最佳的退火温度、Taq聚合酶量、dNTPs浓度和Mg2+浓度分别为60.7℃、1.0U、0.8mmol/L和2.5mmol/L。多重RT-PCR各病毒的灵敏度与单重RT-PCR相同。

多重RT-PCR区分PRRSV变异株和经典株方法的建立

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株基因序列,设计合成了2对引物,分别扩增NSP2和N SP 9部分基因片段,建立了一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。该方法扩增PRRSV变异株时可获得380 bp的特异性片段,扩增PRRSV经典株时则获得380 bp和680 bp两条特异性片段,根据RT-PCR产物可将两者区分开来。试验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点,是一种快速准确检测PRRSV的方法。

猪促炎细胞因子多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立及应用定量检测猪促炎细胞因子mRNA表达水平的方法，从分子水平研究脑心肌炎病毒（EMCV）的致病机制，分别构建含有猪促炎细胞因子IL～1β、IL～6、TNFQ以及管家基因β-actin基因片段的重组质粒标准品，