基于多重RT⁃PCR扩增与双链cDNA合成的A组轮状病毒全基因组测序效果比较

建立A组轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)全基因组单管多重RT⁃PCR扩增方法,并比较其与双链cDNA合成方法在RVA临床标本全基因组二代测序中的应用。对2022年某哨点医院的18份腹泻住院患儿RVA阳性粪便标本进行核酸提取,分别用单管多重RT⁃PCR扩增方法对RVA全基因组进行扩增,用随机引物对病毒核酸进行反转录及双链cDNA合成,最后采用Illumina平台对这2种不同类型的产物进行二代测序。用CLC软件对测序数据进行拼接,分析有效数据量、测序深度及全基因组覆盖度等参数,并用IGV软件查看全基因组测序深度覆盖轨迹。多重RT⁃PCR扩增产物测序和双链cDNA测序获得的RVA有效数据量分别为69.39%~99.83%和0.38%~92.99%,平均测序深度分别为10172×~68156×和35×~61783×,全基因组测序深度10×以上的位点覆盖度分别为98.93%~100.00%和86.28%~100.00%。从全基因组测序深度情况来看,多重RT⁃PCR扩增产物测序在同一个基因节段内部测序深度较为均匀,在11个节段之间测序深度差别较大;而双链cDNA测序在不同基因节段之间的测序深度较为均匀,但同一个基因节段内部靠近5'和3'末端测序深度较低。2种方法所获得的病毒核苷酸序列基本一致,部分基因节段在5'或3'末端100 bp区域内存在2个以内的核苷酸位点差异。在多重RT⁃PCR扩增方法中鉴于引物在不同基因型别间的特异性,对本研究中未涉及到的基因型别的扩增效率还有待进一步验证。单管多重RT⁃PCR扩增方法和双链cDNA合成方法虽然各有优缺点,但均适用于轮状病毒全基因组二代测序在基层的推广。

影响多重PCR扩增效果的因素

不同循环参数、PCR缓冲液及反应体积的对比实验表明,循环参数中退火温度和时间、延伸时间及PCR缓冲液的成分影响多重PCR的扩增效果,而反应体积、循环次数对其扩增效果影响较小。

中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究 Ⅲ.多重PCR技术在玉米SSR引物扩增中的应用

根据21对玉米SSR引物扩增片段大小范围组成不同的引物组合进行多重PCR反应的研究。在与单一PCR相同的反应条件下,47个两重PCR组合出现5种不同的扩增情况,其中30个组合扩增正常;10个三重PCR组合中有9个组合扩增正常;两个四重PCR组合中有1个扩增正常,这些筛选出的正常扩增的组合可应用于今后玉米DNA指纹库构建研究中。研究表明,应用与单一PCR完全相同的反应条件,大部分能够获得正常扩增的多重PCR组合,在此基础上提出了简化的多重PCR优化程序。

扩增内标在副溶血弧菌多重PCR检测方法中的应用

建立扩增内标存在下同时检测副溶血弧菌tlh基因和trh基因的多重PCR方法。以细菌16SrDNA片段为扩增内标对照(internal amplification control,IAC),副溶血弧菌不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)基因tlh和相对耐热直接溶血毒素(thermostable related hemolysin,TRH)基因trh为检测基因,设计引物,并优化多重PCR体系。特异性及灵敏度试验结果表明:该多重PCR体系检测致病性副溶血弧菌表现出极好的特异性。纯培养条件下,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为1.3×102 cfu.mL-1和1.3×103 cfu.mL-1;人工污染牡蛎样品,不经富集培养,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为2.6×103 cfu.mL-1和2.6×104 cfu.mL-1;经过6h的富集培养,tlh基因和trh基因的检测限均能达到2.6×102 cfu.mL-1。该检测体系特异性强、灵敏度高,并且扩增内标的存在可排除PCR检测致病性副溶血弧菌可能导致的假阴性结果,可提高检测的速度和精准度。

食源性致病菌多重实时荧光PCR检测扩增内标的构建及评价

多重实时荧光PCR在食源性致病菌检测中具有重要的作用,扩增内标(IAC)可用来指示其检测过程中可能出现的假阴性检测结果。采用来源于人类腺病毒基因的一段序列设计IAC,并对其检测特异性、扩增效率以及与目的致病菌基因组DNA的抗干扰扩增能力进行了评估。结果表明,本IAC引物在供试菌株中均没有非特异性扩增结果,扩增效率达99.44%,而且对供试沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠杆菌O157:H7(Escherichiacoli O157:H7)以及单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重实时荧光PCR扩增没有任何干扰,在食源性致病菌多重检测技术的建立中具有广泛的应用前景。

猪微卫星标记多重PCR扩增组合

采用多重PCR的方法,以快速扩增微卫星标记和节约试剂为目标,对其反应条件进行优化后,获得了46个扩增效果理想的微卫星标记多重PCR组合,其中30个为二重PCR,16个为三重PCR。实验结果表明,这些多重PCP反应的引物浓度为0.06～0.3μmol/L,Mg2+的浓度变化范围为1.5～3.0mmol/L,采用的PCR缓冲液的倍数为1.0、1.2、1.4或1.6,每个PCR反应聚合酶的用量在0.2和0.4U之间,退火温度及反应循环数分别为52～60℃和32～50℃。所有多重PCR进一步合并为17个可在ABI337测序仪上进行电泳的组合。

31个SNP位点多重PCR扩增和芯片分型技术的建立及其法医学应用

目的对SNP基因分型芯片在个体识别中的应用价值进行研究。方法根据SNP不同等位基因的序列设计探针,制成分型芯片。采用4个复合PCR体系,用末端标记了Cy5的引物进行复合PCR扩增,产物与寡核苷酸探针进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值确定样品在各SNP位点的基因型。将这一方法应用于109份样本的分型,根据基因型分布统计分析31个SNP位点的法医学应用价值。同时,进行家系调查和方法灵敏度分析。结果方法的灵敏度为1ng;所检测的31个SNP位点的累积个体识别率为0.9999999999979(偶合率为2.13×10-12),二联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9609,三联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9970。家系调查的结果表明,这些位点等位基因由亲代向子代的传递符合孟德尔遗传定律。结论上述31个SNP位点为中高信息量位点,适用于法医学个体识别,可作为当前STR系统的补充。

甲基化特异性多重连接探针扩增及甲基化特异性PCR诊断Prader-Willi综合征方法比较

目的应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)和甲基化特异性多重连接探针扩增(methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-MLPA)方法对Prader-Willi综合征(Prader-Willi syndrome,PWS)进行诊断并比较两种方法的差异。方法回顾性研究2005年10月至2014年2月到北京协和医院就诊的患儿及正常对照共102例,男57例,女45例。其中正常对照16例;荧光原位杂交或高分辨染色体确诊PWS阳性对照2例;临床疑似PWS患儿84例。提取受试者外周血基因组DNA分别应用MS-PCR及MS-MLPA方法进行基因分析,对疑似患儿进行确诊和遗传类型分型,并计算两种方法的特异性、敏感性及准确度,应用卡方检验对两种方法进行比较。结果 MSPCR结果示正常对照及阳性对照与其表型全部相符,84例疑似患儿中有39例提示为PWS,45例提示正常。MS-MLPA结果示除正常对照外的86例受试者中,29例提示为父源缺失型PWS;9例提示为母源二体型PWS;47例提示为正常;1例因DNA过于陈旧未检出有效结果。对比两种方法检测结果,有2例MS-PCR结果显示为PWS,但MS-MLPA结果显示为正常,通过增加DNA用量重新进行MS-PCR检测后,除外PWS。结合临床表现,受试者中明确诊断PWS的患儿39例,非PWS者63例。MS-PCR方法共出现2例假阳性,假阳性率为3.17%(2/63)。MS-PCR方法敏感性100%,特异性96.83%,准确度98.03%;MS-MLPA方法敏感性97.43%,特异性100%,准确度99.02%。两种方法的敏感性、特异性及准确度差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 MS-PCR及MS-MLPA敏感性、特异性及准确度皆佳,均可用于PWS诊断,MS-MLPA可区分父源缺失型及母源二体型。MS-PCR应保证DNA用量充足以避免假阳性出现。MS-MLPA应使用新鲜提取的DNA,且实验条件要求更为严格。建议同时使用两种方法检测以获得准确结果。

RT-PCR方法扩增白蛉热病毒M片段的研究

为建立扩增未知序列白蛉热病毒M片段的RT-PCR方法,本研究选取7个血清组成员和8个未分组血清型,共42株白蛉热病毒为RT-PCR检测对象。通过排列GenBank中已知的4型白蛉热病毒M片段氨基酸序列,选择保守区设计引物。根据保守区各已知病毒的cDNA特异序列合成寡核苷酸,将相同区的寡核苷酸等量混合成为“鸡尾酒”引物,用于RT-PCR。扩增产物经电泳检测,纯化后直接测序。引物对Ph-M-2FM和Ph-M-3RM扩增产物长度约为600bp,从42株病毒中扩增出34株,阳性率为81.0％。另一引物对Ph-M-2FM和Ph-M-4R2M扩增产物长度约为1400bp,扩增出22株病毒,阳性率为52.3％。测出序列经BLAST检索,与GenBank中已知白蛉热病毒同源。本研究首次成功地应用RT-PCR扩增不同血清型未知序列白蛉热病毒的部分M片段,并测出扩增产物序列,为白蛉热病毒属成员的基因鉴定和种系发生关系分析提供了实验手段,并将有助于白蛉热病毒感染的基因诊断。

颌骨肿瘤中骨形成蛋白-2基因扩增的RT-PCR研究

目的探讨颌骨肿瘤中骨形成蛋白(BMP)-2基因的扩增与颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间的关系。方法采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测9类87例新鲜颌骨肿瘤标本中BMP-2基因扩增结果。结果含肿瘤性硬组织的全部42例颌骨肿瘤(骨肉瘤、软骨肉瘤、牙源性纤维瘤、骨化性纤维瘤、化牙骨质纤维瘤)和部分颌骨成釉细胞瘤(27/31)均显示人BMP-2特异性扩增条带,而不含肿瘤性硬组织的其他颌骨肿瘤(牙源性钙化上皮瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤)均未见特异性扩增条带。结论颌骨肿瘤中BMP-2基因扩增存在差异,BMP-2基因扩增与肿瘤性硬组织的形成有关,与某些颌骨肿瘤的发生、发展及生物学行为之间存在一定关系。

巢式RT-PCR扩增MMP-7诊断大肠癌淋巴结的微转移

目的:建立巢式逆转录聚合酶链式反应(nestedreversetranscriptase-polymerasechainreaction,nestedRT-PCR)扩增MMP-7mRNA,检测大肠癌淋巴结微转移.方法:据MMP-7基因序列设计两对引物,建立巢式RT-PCR扩增体系,检测MMP-7mRNA在30例行根治性手术大肠癌患者187个淋巴结中及10例良性肠道疾病患者25个淋巴结中的表达,并与传统组织学检查相比较.结果:大肠癌患者30例187个淋巴结中97个MMP-7mRNA表达,阳性率51·87%(97/187),病理学检查仅57个淋巴结有肿瘤转移;10例良性肠道疾病25个淋巴结扩增结果阴性.结论:巢式逆转录聚合酶链式反应检测淋巴结MMP-7mRNA的表达是诊断大肠癌微细胞转移灵敏的指标,其结果较常规病理组织学检查敏感,可对精确大肠癌的临床分期、判断患者预后及治疗提供一定理论依据.

脾源鸭γ-干扰素基因的RT-PCR扩增、序列分析及表达

从丝裂原刺激的鸭脾淋巴细胞中提取基因组 RNA,采用 RT-PCR 扩增鸭干扰素γ基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸭干扰素γ基因序列全长477bp,开放阅读框架内401个核苷酸,共编码132个氨基酸。将鸭γ-IFN 基因定向克隆到原核表达载体pBV220中,重组质粒经酶切鉴定后,转化到宿主菌 DH5a 中,温度诱导表达,SDS-PAGE 分析,表达产物与标记抗鸡干扰素抗体出现 Dot-ELISA 阳性反应。

多重RT-PCR同步快速检测A型和B型流感病毒

目的 建立特异、敏感、快速、同步检测含漱液中A、B型流感病毒的分子生物学检测方法。 方法 以流感病毒A型保守的M基因和流感病毒B型的NS基因为模板分别设计的两对引物 ,用MRT -PCR同时扩增A型M基因和B型NS基因的片断 ,得到相对应的病毒片段 ,根据扩增出的片段的位置和大小来判断含漱液中A、B型流感病毒分型。 结果 用MRT -PCR从 19株A型流感病毒毒株和 11株B型流感病毒毒株分别特异地扩增出M基因 5 0 1bp的片段和NS基因 13 6bp的片段 ,灵敏度可达 1 6× 10 -5TCID5 0 ;对 2份黑天鹅的咽拭子和肺组织标本均检出A型流感病毒M基因 5 0 1bp的片段。 结论 多重逆转录聚合酶链反应能特异、敏感快速的检测A、B型流感病毒。

线虫PCR:直接针对秀丽线虫进行PCR扩增基因组DNA的新方法

目的:直接针对秀丽线虫进行PCR反应,以便快速扩增基因组DNA,从而提高钓取目的基因和鉴定基因组是否发生突变的效率。方法:根据生物信息学分析,针对不同基因设计单重或多重PCR引物;在不含Taq DNA聚合酶的PCR反应体系中加入蛋白酶K消化秀丽线虫染色体中的组蛋白,然后加入Taq酶,直接针对野生型或突变型秀丽线虫个体进行PCR反应,无须提前制备基因组DNA。结果:用该方法能直接从秀丽线虫体内的基因组DNA中扩增出目的基因片段,与常规预先制备基因组DNA为模板的扩增产物条带位置一致,且特异性更高。同时,针对不同基因的多重PCR亦能扩增出理想的目的基因片段。结论:直接针对秀丽线虫进行PCR能够实现基因组DNA的快速扩增和鉴定,在保证反应特异性的同时,还能显著提高PCR反应的灵敏度,为秀丽线虫基因组的快速鉴定提供了一种便捷方法。

细胞裂解法对单细胞PCR扩增效率的影响

目的 研究细胞裂解法对单细胞PCR扩增效率的影响 ,寻求较好的细胞裂解方法。方法 应用显微分离技术分离单个淋巴细胞 ,分别使用冻融变性和蛋白酶K裂解法处理单细胞 ,应用多重PCR同时扩增X染色体特异重复序列(DXZ1)和Y染色体特异重复序列 (DYZ1)对单细胞进行性别诊断 ,比较其扩增效率。结果 使用显微操作法获得 80个男性淋巴细胞。采用冻融变性处理单细胞 ,4 0个淋巴细胞经多重PCR扩增后有 32个产生DXZ1和DYZ1两条电泳带 ,正确率为80 %。采用蛋白酶K裂解法 ,4 0个淋巴细胞经多重PCR扩增后均产生DXZ1和DYZ1两条电泳带 ,正确率为 10 0 %。两者的扩增效率有显著的差异性 (χ2 =6 .81,P<0 .0 1)。结论 Rechitsky等的蛋白酶K裂解法比较简便 ,费时短 ,扩增效率高 ,适合细胞裂解及PCR扩增模板的制备。

多重置换扩增在植入前胚胎性别诊断中的应用

目的用多重置换扩增(MDA)方法,对植入前胚胎的单个卵裂球全基因组扩增后进行植入前胚胎性别的遗传学诊断。方法用单细胞多重置换扩增方法对20个胚胎共20个单卵裂球进行全基因组扩增,用荧光PCR检测SRY、AMEL、XHPRT及X22 4个性别相关的基因座,检测胚胎性别,同时用同一胚胎另一卵裂球FISH结果作为对照。结果 20个卵裂球MDA均扩增成功,扩增成功率100%。20个胚胎均得到诊断,性别诊断成功率100%,其中12例为男性胚胎,8例为女性胚胎,与FISH结果一致率100%,诊断准确率100%。结论可以用单卵裂球MDA后荧光PCR检测多个基因座的方法对胚胎性别进行快速、准确的植入前诊断。

单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性

目的:建立了一种单管等位基因特异性扩增法同时测定多重单核苷酸多态性(SNP)。方法:以TYR基因外显子1上的3个SNP位点(71G>A、425A>T和758G>A)为例,首先采用PCR预扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;然后用限制性内切酶将其消化成短片段,在连接酶的作用下与设计的DNA适配器相连;以此连接产物为模板,在单个PCR管中加入一种适配器特异性通用引物和所有等位基因特异性引物进行PCR扩增;最后用琼脂糖凝胶电泳法分离检测PCR扩增产物,并根据扩增片段的大小判断SNP的类型。结果:采用该法成功测定了30名健康中国人的TYR基因中的3个SNP位点,与限制性片段长度多态性法(RFLP)测定结果完全一致。结论:该方法特异性高、结果准确、检测成本低,可用于同时测定多个SNP位点。

应用MLPA联合qPCR技术鉴定并分析流产原因

应用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)联合实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测流产组织染色体异常以及感染B族链球菌(group B streptococcus, GBS)的情况,分析流产原因。方法 收集流产胚胎的绒毛组织样本,提取基因组DNA,先应用MLPA-P036和MLPA-P070两个试剂盒探针进行染色体非整倍体畸变检测,然后从检测结果中筛选阴性样本,再采用qPCR技术检测GBS的定植情况,分析流产的原因。结果 共收集1182例样本,染色体异常检出率为56.60%(669/1182),其中染色体非整倍畸变占所有异常染色体91.03%(609/669),比例最高的前四位依次为47,XN,+16为21.08%(141/669)、47,XN,+22为12.71%(85/669)、45,XO为9.12%(61/669)、47,XN,+21为7.32%(49/669)。1号和19号尚未发现非整倍体异常。未检测出23对染色体非整倍体数目异常的513例样本中,检出GBS阳性2例,占比为0.39%(2/513)。结论 染色体非整倍体畸变是早期流产最常见的遗传学病因,GBS感染导致的流产亦不容忽视,MLPA联合qPCR技术,可为流产患者提供染色体畸变等遗传学病因及病原学病因,为优生优育提供更全面的实验室依据。

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的 建立一种多重聚合酶链反应 (PCR)方法 ,对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法 采用 4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT PCR)反应 ,继用 4对 (5种 )型特异引物在单管内进行巢式PCR ,依据扩增产物的片段大小进行分型。结果 采用多重PCR ,扩增出 4 82、119、2 90及 392bp的特异片段 ,分别代表登革病毒 1～ 4型。结论 该方法快速、敏感、特异 ,有一定的推广应用价值。

应用多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒和桃拉病毒

研究建立了一种可同时检测对虾白斑综合征病毒 (WSSV)和桃拉病毒 (TSV)的多重聚合酶链式反应 (多重PCR)技术。根据 WSSV和 TSV基因序列 ,设计合成了 2对分别与 WSSV和 TSV某段基因序列互补的引物 ,用这 2对引物对同一样品中的 WSSV DNA和 TSV RNA模板进行多重 PCR扩增 ,结果均同时得到了 2条特异的与实验设计相符的 30 6 bp(WSSV)和 2 31bp(TSV)多重 PCR扩增带 ,而对其他对虾病病原的 PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重 PCR技术能检出 10 pg的 WSSV DNA和 1pg的 TSV