多重qPCR技术检测幽门螺杆菌及其耐药基因用于精准治疗的初步探讨

目的评估不同来源标本幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)耐药基因检测的准确性及精准用药后的治疗效果。方法411例患者利用^(13)C/^(14)C及多重qPCR技术检测H.pylori及耐药基因,Kappa检验评估试剂盒检测胃黏膜、粪便及唾液等结果与^(13)C/^(14)C检测结果的一致性,统计H.pylori检出率、耐药率。其中试剂盒检测141例H.pylori阳性者为精准治疗组;同时期200例^(13)C/^(14)C检测H.pylori阳性者为传统治疗组,分别统计H.pylori清除率。结果胃黏膜的阳性检出率(34.3%)最高,接近^(13)C/^(14)C的阳性检出率(37.2%),其次是粪便(28.7%),检出率最低是唾液(9.2%)。胃黏膜与^(13)C/^(14)C检测一致性最好(Kappa=0.962,P<0.001),粪便与^(13)C/^(14)C检测一致性较好(Kappa=0.874,P<0.001);唾液与^(13)C/^(14)C检测一致性差(Kappa=-0.010,P=0.662)。胃黏膜检测141例H.pylori阳性者有64例耐药,总耐药率为45.4%。甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林及左氧氟沙星耐药率分别为23.4%、37.6%、2.1%及39.7%。唾液检测38例H.pylori阳性者有9例耐药,总耐药率为23.7%。甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林及左氧氟沙星耐药率分别为13.2%、23.7%、0及18.4%。粪便检测118例H.pylori阳性者有37例耐药,总耐药率为31.4%。甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林及左氧氟沙星耐药率分别为13.6%、20.3%、0.8%及24.6%。精准治疗组清除率优于传统治疗组(P<0.001)。结论基于多重qPCR技术的试剂盒可以用来检测H.pylori及其耐药基因。其中胃黏膜和粪便H.pylori检出率较高,可以作为临床检测H.pylori及其耐药基因的合适样本,从而指导临床用药达到精准治疗。

多重qPCR法鉴定麦卢卡蜂蜜

目的运用新西兰政府初级产业部(Ministry of Primary Industry, MPI)提出的多重qPCR方法鉴定麦卢卡蜂蜜。方法参照MPI提出的多重qPCR方法,建立麦卢卡标准曲线,提取15个未知来源的蜂蜜样品样品中的花粉DNA,进行样品多重qPCR检测分析。结果建立麦卢卡标准曲线获得Manuka通道的阈值范围,可以用于今后蜂蜜样品的麦卢卡特异性分析。M2-4蜂蜜样品中的花粉DNA不来自麦卢卡树Leptospermum scoparium。结论本研究对MPI提出的鉴定麦卢卡蜂蜜方法起到很好的推动及指导作用。

直接多重TaqMan qPCR方法快速鉴定褐飞虱属3种飞虱

【目的】褐飞虱(Nilaparvata lugens)是水稻重大害虫,灯光诱捕一直是褐飞虱监测的重要方法。然而,褐飞虱的两个同属近似种伪褐飞虱(N.muiri)和拟褐飞虱(N.bakeri)也具有扑灯行为,常被误判为褐飞虱。针对测报灯下褐飞虱属近似种形态鉴定费时费力、专业技能要求高,伪褐飞虱和拟褐飞虱常被误判为褐飞虱这一问题,拟建立一种褐飞虱属3种飞虱的快速分类鉴定方法。【方法】以条形码基因ITS1为靶标,筛选褐飞虱属通用引物及物种特异性探针,建立并优化直接多重Taqman qPCR检测体系(Direct Multiplex TaqMan quantitative PCR,dmTqPCR),并分析其特异性、灵敏度及实用性。【结果】本研究建立的3种飞虱dmTqPCR检测方法特异性强,可准确区分褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱;灵敏度高,检出限可达10拷贝/反应;大样本检测结果表明,382个样本从样本获取到结果输出的整个过程可在3 h内完成,检出率及准确率均为100%。【结论】本研究建立的褐飞虱属近似种的dmTqPCR鉴定方法可以用于褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱的快速分类鉴定,有利于灯下褐飞虱的精准测报。

骨折相关感染5种常见病原菌的多重qPCR体系建立及应用

目的建立一种快速检测骨折相关感染(fracture-related infection,FRI)的方法。方法利用5种临床常见致病菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、阴沟杆菌)的特异DNA序列,设计特异的引物和探针,建立FRI常见致病菌的多重qPCR检测方法。结果建立的多重qPCR方法具有较好的特异性,其检测循环阈值(Cycle threshold,Ct)与各质粒DNA浓度有良好的线性关系。且多重qPCR(AUC=0.73;95%CI,0.46-0.80)的检测性可与组织培养法(AUC=0.88;95%CI,0.67-0.96)结果相符,检测时间<5 h。结论该FRI检测方法诊断快速、敏感,结果稳定,可应用于FRI的多种细菌感染检测。

多重荧光定量PCR技术快速检测养殖场中铜绿假单胞菌方法的建立及评价

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一种重要的人畜共患病的条件致病菌,不仅会危害人体健康安全,而且严重影响养殖业的发展。本研究旨在建立一种四重qPCR(定量聚合酶链反应)技术用于快速精准检测PA并鉴定其毒性强弱。结果发现本研究建立的四重qPCR方法能够同时、定量检测PA中四种毒力基因,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于实际样本检测。因此,本研究建立的方法检测性能优越,适用于检测实际样本中PA及其四种重要的毒力基因。

基于分子信标探针RT-qPCR快速检测坚果中的霉菌

霉菌污染是坚果质检不合格的主要原因,实现其快速检测对于坚果行业发展具有重要意义。曲霉属、青霉属和镰刀菌属是坚果霉菌污染的主要污染菌群,根据其内转录间隔区(ITS)基因序列设计引物及3对特异性分子信标探针,建立了一种同时检测坚果中曲霉属、青霉属和镰刀菌属的多重实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测方法。通过对qPCR反应体系进行优化,得到良好的扩增曲线和标准曲线,该方法的检出限分别为:曲霉属2.5×10^(-2)ng/mL(约741 CFU/g),青霉属8.7×10^(-3)ng/mL(约500 CFU/g),镰刀菌属5.6×10^(-3)ng/mL(约454 CFU/g)。本研究为坚果中霉菌的检测提供了一种快速准确的方法,相对于国标检测方法需要耗时7 d,本方法用于检测坚果中的霉菌,用时仅为3 d。

恙虫病东方体超快速检测方法的建立及评价

目的:建立一种可以在基层医疗机构使用的超快速恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)核酸检测方法。方法:利用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR),通过比对分析数据库中恙虫病东方体全基因组序列确定靶基因,设计qPCR特异性引物和探针,优化反应体系和反应程序,建立超快速多重qPCR检测方法;利用经过数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量后的样本核酸作为标准物质,评价该方法的灵敏度、重复性以及最低检出限;通过比较基因组学分析,验证恙虫病东方体与同科属的易引起类似症状的病原体的特异性,通过检测24种(共45例)易引起类似症状的其他病原体核酸评价特异性;利用116例来源于云南省红河州金平县人民医院和复旦大学附属华山医院的临床全血样本,通过四格表卡方检验对多重qPCR超快速检测方法和传统qPCR检测方法的检测结果进行比较,采用Kappa一致性检验分析方法间的一致性。结果:恙虫病东方体与同科属的易引起类似症状的病原体的同源性较低,与常见的易引起类似症状的24种病原体无交叉反应,具有很好的特异性;最低检出限为156 copies/mL;具有很好的重复性,检测Ct值的变异系数≤3.13%;多重qPCR超快速检测方法和传统qPCR检测方法同时检测116例临床全血样本,检测结果的差异无统计学意义(P>0.05),两种方法具有很高的一致性(Kappa=0.9392,P<0.001),总符合率97.42%(CI:92.67%~99.12%),检测时间可缩短至30 min。结论:建立的多重qPCR超快速检测方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可以快速诊断临床全血样本中的恙虫病东方体核酸,在基层医疗机构实现及时快速诊疗。