结核分枝杆菌抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6和Rv2031c-Rv2626c重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础。方法体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿梭载体。PCR扩增课题组前期构建的AE、R2融合蛋白基因,并依次亚克隆至上述腺病毒穿梭载体的CMV和EF1启动子下游,阳性重组穿梭质粒命名为pAd-AE-R2。将pAd-AE-R2与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装获得重组腺病毒,命名为Ad-AE-R2。RT-PCR法和间接免疫荧光法(IFA)对重组腺病毒表达的AE、R2融合蛋白的基因和蛋白表达水平进行鉴定。结果Ad-AE-R2瞬时转染的HEK293细胞中可转录表达AE、R2融合蛋白基因。IFA法采用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c和Rv2031c 4种抗原的单克隆抗体可分别检测到Ad-AE-R2感染的巨噬细胞中具有特异性的绿色荧光,表明Ad-AE-R2能够在宿主细胞内表达AE、R2融合蛋白。结论成功构建并包装获得表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白AE、R2的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗研究奠定基础。