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抗真菌肽CGA-N46基因多顺反子表达载体的构建与鉴定
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作者 李瑞芳 熊前程 +2 位作者 张宗武 黄亮 王彬 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期93-98,共6页
目的:为提高抗真菌肽CGA-N46表达量,对该基因多顺反子表达进行研究。方法:以pEASY-Blunt为克隆载体,以"pET-30a rbs序列-起始密码子-CGA-N46编码序列-终止密码子"为外源片段,利用同尾酶Nhe I、Spe I和Xba I,构建了含有上述外... 目的:为提高抗真菌肽CGA-N46表达量,对该基因多顺反子表达进行研究。方法:以pEASY-Blunt为克隆载体,以"pET-30a rbs序列-起始密码子-CGA-N46编码序列-终止密码子"为外源片段,利用同尾酶Nhe I、Spe I和Xba I,构建了含有上述外源片段1、3、5、8拷贝的重组载体pT-CAN46、pT-3CAN46、pT-5CAN46和pT-8CAN46;将pEASY-Blunt上的外源基因片段亚克隆至pET-30a的rbs序列下游,构建了CGA-N46基因1、3、5、8顺反子的重组表达载体pET-CAN46、pET-3CAN46、pET-5CAN46和pET-8CAN46;利用感受态转化法转化大肠杆菌Rosetta,进行了表达研究。结果:在IPTG诱导下,CGA-N46基因1、3、5、8顺反子重组表达载体均能表达CGA-N46单体,各重组表达载体表达CGA-N46的量在总蛋白中的百分含量分别为3.4%、5.0%、12.4%、17.1%。结果表明随着CGA-N46基因顺反子个数的增加,外源蛋白表达量也越来越多。其中,8顺反子表达量最高,实现了CGA-N46的高效表达。结论:多顺反子表达可以克服融合表达和串联表达肽类蛋白的不足;创建的多顺反子表达载体构建方法简化了传统基因工程构建方法的步骤,为基因工程有效提高小肽表达量奠定了基础。 展开更多
关键词 抗真菌肽 CGA-N46 多肽基因工程表达 多顺反子表达 载体构建
原文传递
油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体的构建
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作者 李文品 廖玉才 +1 位作者 黄涛 李和平 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期460-466,共7页
根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被... 根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 油菜(Brassica napus) 叶绿体 同源重组 多顺反子表达载体
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HLA-E cDNA克隆及在LcL721.221细胞的表达 被引量:2
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作者 赵亮 范丽安 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期403-405,424,共4页
目的克隆 HL A- E c DNA,并使其在 HL A 类阴性的靶细胞 L c L72 1.2 2 1细胞上获得稳定表达。方法用 RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞扩增出 HL A - E c DNA ,并通过内核糖体进入位点 (IRES)将目的基因亚克隆于已经载有 HL A-A2的逆转录... 目的克隆 HL A- E c DNA,并使其在 HL A 类阴性的靶细胞 L c L72 1.2 2 1细胞上获得稳定表达。方法用 RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞扩增出 HL A - E c DNA ,并通过内核糖体进入位点 (IRES)将目的基因亚克隆于已经载有 HL A-A2的逆转录病毒表达载体 p GCEN上 ,构建成 HL A - A 2 / E多顺反子表达载体 (p G/ A2 E) ,采用感染的方法将重组质粒转入L c L 72 1.2 2 1细胞 ,最后经 G418筛选及有限稀释 ,利用抗 HL A- E特异的单克隆抗体 3D12进行 FACS检测 ,以观察 HL A - E分子在靶细胞表面的表达情况。结果 HL A- E分子在经 p G/ A2 E转染的靶细胞表面获得明显的表达 (88.79% ) ,且显著高于表达 HL A- E的对照细胞株 JAR(2 6 .2 1% ) ,而经 p G/ A2载体转染的靶细胞则未获得表达。结论成功构建了 p G/ A2 E多顺反子表达载体 ,并使 HL A- E分子在 HL A 类阴性的 L c L72 1.2 2 展开更多
关键词 HLA-E 多顺反子表达载体 LcL721.221 先导肽 CDNA 克隆
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Construction of Double Cross-over Expression Vector for Chloroplast Multicistron in Brassica napus L. 被引量:1
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作者 武玉永 姚庆收 马立新 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2013年第3期402-406,共5页
[Objective] This study aimed to construct Brassica napus chloroplast multi- cistron double cross-over expression vector, to lay the foundation for the genetic engi- neering research of Brassica napus chloroplast. [Met... [Objective] This study aimed to construct Brassica napus chloroplast multi- cistron double cross-over expression vector, to lay the foundation for the genetic engi- neering research of Brassica napus chloroplast. [Method] Two primers were designed based on the known Brassica napus chloroplast DNA sequences AF267640 and Z50868 in GenBank. By using PCR method, two Brassica napus L. chloroplast DNA fragments were obtained, which were named RbcL and ACCD. The two Brassica na- pus chloroplast DNA homologous fragments were then cloned into plasmid pMD18-T to obtain recombinant plasmid pHBM715. Tandem expression cassette harboring spectinomycin-resistant gene aadA, mannanase gene man and green fluorescent pro- tein gene gfp was cloned into the plasmid pHBM715, thereby constructing Brassica napus chloroplast multicistron double cross-over expression vector pHBM716, which was transformed into Escherichia coil for expression and identification. [Result] Plate qualitative analysis was conducted for the functional identification of expression cas- sette in the constructed Brassica napus chloroplast multicistron double cross-over ex- pression vector, results showed that the three genes of the same multicistron were all expressed in E. coil [Conclusion] This study successfully constructed Brassica napus chloroplast multicistron double cross-over expression vector, which laid the foundation for the genetic engineering of Brassica napus chloroplast. 展开更多
关键词 Brassica napus L. Chloroplast DNA Multicistron Double cross-over Expression vector Functional identification
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