响应面法优化多黏类芽孢杆菌BD3736发酵脱脂乳产α-葡萄糖苷酶抑制剂的工艺条件

多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BD3736具有代谢脱脂乳、合成α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-glucosidase inhibitors,AGIs)的能力。通过单因素试验,初步分析接种量、发酵温度、脱脂乳质量浓度及培养时间对AGIs的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响,并确定主要的影响因素;继而采用3因素3水平的响应面分析法,对多黏类芽孢杆菌BD3736在发酵脱脂乳中合成AGIs的发酵条件进行优化,获得的最优发酵条件为发酵温度31.5℃、接种量3.5%、培养时间4 d。在此条件下,发酵液上清对α-葡萄糖苷酶的半数最大抑制质量浓度为30.5 mg/mL。

多黏类芽孢杆菌的生防机制研究进展

多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一种常见的植物根际促生细菌(PGPR),具有巨大的生物防治潜力,且在可持续农业中发挥的作用越来越重要。多黏类芽孢杆菌可以防治细菌、真菌、线虫和病毒,这是通过生产各种抗菌物质、生长必需物质的竞争以及通过引发植物的过敏防御反应来实现的。多黏类芽孢杆菌衍生的抗菌物质包括葡聚糖酶、几丁质酶、淀粉酶、纤维素酶、黏菌素、羊毛硫菌素、杀镰孢菌素、多肽菌素等,生长必需物质的竞争主要是铁载体,可通过诱导系统抗性(ISR)引发植物的过敏防御反应。因此,多黏类芽孢杆菌是生产生物农药的重要菌种,由多黏类芽孢杆菌及其衍生物制备的微生物农药以其良好的环境友好性、生物防治机制的多样性和对土壤病害的良好防治效果,成为植物病害防治的重要策略之一。探究多黏类芽孢杆菌的生防机制具有重要的理论和应用价值,并对近年来多黏类芽孢杆菌通过产生抗菌物质、竞争作用以及诱导植物抗病性等生防机制的研究进展进行综述。

海洋多黏类芽孢杆菌L_1-9菌株抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用

通过硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析、Sephadex G-200柱层析,以小麦蠕孢病菌和金黄色葡萄球菌为指示菌采用抑菌活性追踪和SDS-PAGE跟踪检测,从分离自连云港海域、对多种病原真菌具有抑菌作用的多黏类芽孢杆菌L1-9菌株发酵液中分离纯化得到一种对金黄色葡萄球菌和小麦蠕孢病菌的菌丝生长及孢子萌发具有抑制作用的抗菌蛋白,分子质量约31kD。

西瓜根系分泌物中氨基酸组分对多黏类芽孢杆菌SQR-21趋化性及根际定殖的影响

[目的]根系分泌物介导的微生物趋化性是植物促生细菌根际定殖及功能发挥的重要前提,深入理解该过程对指导促生菌的合理施用具有重要意义。[方法]通过氨基酸分析仪鉴定西瓜根系分泌物中的主要氨基酸组分,并通过滴定分析法(drop assay)和类毛细管法比较促生多黏类芽孢杆菌SQR-21对不同氨基酸组分的趋化性,最终通过原位试验研究外源添加氨基酸对菌株SQR-21在西瓜根际定殖的影响。[结果]西瓜根系分泌物中包含天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸。滴定分析法表明:菌株SQR-21对上述13种氨基酸中除甲硫氨酸和酪氨酸以外的11种氨基酸均存在趋化性,其中对苏氨酸、精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸的趋化性较强;类毛细管定量试验进一步表明:菌株SQR-21对不同浓度氨基酸的响应不同,菌株SQR-21对中等浓度的氨基酸(40~80μmol·L^(-1))表现出较强的趋化性,其中对精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸具有强烈的正趋化作用。综合考虑滴定分析试验和类毛细管试验的结果,设计试验研究原位外源添加精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸对菌株SQR-21根际定殖的影响,结果表明60μmol·L^(-1)的精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸均能明显促进菌株SQR-21在西瓜根际的定殖,进一步验证了菌株SQR-21对这3种氨基酸的趋化作用。[结论]西瓜根系分泌物中的精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸可诱导菌株SQR-21对西瓜根系的趋化性并促进其在西瓜根际有效定殖。

多黏类芽孢杆菌JSa-9电转化方法的优化

为建立多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株的高效电击转化体系,本实验研究菌体培养时间、电场强度、电击缓冲液、质粒用量以及电击后复苏培养时间等因素对JSa-9菌株电转化效率的影响。结果表明:Paenibacillus polymyxa JSa-9培养至OD595 nm为0.3时,电转化效率最高,为0.12×103 CFU/μg DNA;用0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞,在电场强度17.5 kV/cm、电阻200Ω,电容25μF的电击条件下,加入1.0μg/100·mL质粒DNA,复苏培养时间18 h,电转化效率达到约为0.36×103 CFU/μg DNA;制备P.polymyxa JSa-9原生质体,在电场强度5.0 kV/cm的电击条件下,加入0.8μg/100·mL质粒DNA,电转化效率较感受态电转提高到约1.0×103 CFU/μg DNA。

多黏类芽孢杆菌HT16对梨采后黑斑病的抑制效果

研究了多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌(Alternaria kikuchiana)的抑制作用,并对其应用效果进行了评价。结果表明,多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌的体外抑制率为53.2%,其粗提蛋白严重破坏了梨黑斑病菌的菌丝和孢子,显著抑制了梨采后黑斑病的发生,呈现出极大的应用潜力。

海洋多黏类芽孢杆菌L_1-9菌株粉剂对黄瓜的促生防病作用

采用含药平板法测定L_1-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻纹枯病菌及菠菜早疫病菌4种植物病原真菌的毒力,建立毒力回归方程,进而采用盆栽试验测定了拌种、拌土及灌根3种用药方法对黄瓜的促生效果及对黄瓜枯萎病的防治作用,为海洋多黏类芽孢杆菌菌剂的研究提供参考依据。结果表明:L_1-9菌株粉剂对菠菜早疫病菌的抑制作用最强,半数有效质量浓度(EC_(50))和90%有效质量浓度(EC_(90))分别为38.312 2 mg/L和66.732 2 mg/L;其对黄瓜枯萎病菌的抑制作用次之,EC_(50)和EC_(90)分别为48.925 2 mg/L和86.713 2 mg/L。L_1-9菌株粉剂3种用药方式均对黄瓜的生长发育产生明显的促进作用,拌土用药后黄瓜地上部分鲜质量增加了243.75%,拌种用药后黄瓜须根数增加了113.11%。L_1-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病有较强的防治效果,拌种、拌土和灌根3种用药方式的防治效果分别为77.12%、81.32%、78.75%。综上,L_1-9菌株粉剂对4种植物病原真菌均具有明显的抑菌作用,且对黄瓜具有明显的促生防病作用。

内生多黏类芽孢杆菌纤溶酶的纯化及其体外溶栓作用

植物内生菌株EJS-3发酵液经离心除菌,硫酸铵分级沉淀,Hiprep phenylFF疏水层析,RESOURCEM Q离子交换层析和Sephacryl S-300HR凝胶过滤,获得电泳纯的多黏芽孢杆菌纤溶酶(PPFE-I),聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子质量为63kD,高效液相色谱法(HPLC)鉴定其纯度为94.1%。每升发酵液中可获得1.6mg活性蛋白,每毫克蛋白活力达2096IU,纯度提高了14.5倍,回收率为3.3%。纯化后的纤溶酶PPFE-I具有明显的体外溶栓作用。

多黏类芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化及特性研究

试验旨在分离纯化多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)BLCC1-0402代谢产物中的抗菌肽,为抗菌肽制备及其制品检测提供参考。采用离心、不同分子质量卷式膜超滤浓缩、Superdex peptide 10/300GL凝胶过滤层析对多黏类芽孢杆菌发酵上清液进行逐级分离纯化,对不同时段的收集液做抑菌试验,以大肠杆菌O78标准菌株为指示菌,采用打孔法进行抑菌活性检测,比较评价分步层析效果,以Tricine-SDS-PAGE进行分子质量检测。结果显示,通过5和3 ku卷式膜超滤获得的3~5 ku组分蛋白质样品抗菌活性较强;对于3~5 ku组分经凝胶过滤层析分离纯化,纯化后的抗菌肽A3抑菌活性最强,经Tricine-SDS-PAGE小分子多肽电泳检测,已达到电泳纯,分子质量为4 ku;抑菌活性检测结果显示,该抗菌肽A3对大肠杆菌O78标准菌株具有较强的抑菌作用。同时,抗菌肽A3表现出较好的耐热性,90~100℃处理15 min,抑菌活性可保持在96%左右;具有较好的酸碱稳定性,在pH 2.0~9.0下,抑菌活性保持在90%以上;经胃蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低20%,胰蛋白酶作用后抗菌肽A3抑菌活性降低18%,蛋白酶K对抗菌肽A3的抑菌活性几乎无影响。本研究结果表明,分离得到的抗菌肽A3是一种对大肠杆菌O78具有抑菌活性的新型抗菌肽,具有一定的开发潜力,可为下一步抗菌肽的结构分析、理化特性分析等深入研究提供一定参考依据。

多黏类芽孢杆菌菌剂在玉米上的应用效果

为研究多黏类芽孢杆菌菌剂对玉米产量和病害的影响,采用随机区组试验方法,进行多黏类芽孢杆菌菌剂对玉米影响的田间试验。结果表明,15、30 kg/hm^(2)多黏类芽孢杆菌菌剂与化肥共同施用比单独施用化肥的出苗率高4.1%、5.3%,玉米幼苗叶绿素含量分别高7.90、14.48 mg/g,过氧化氢酶活性分别高11.1、18.8μmol/(g·min),过氧化物酶活性分别高7.47、15.73 U/(g·min),对玉米根腐病防效分别为74.27%、80.50%,对玉米的增产率分别为9.68%、17.68%。因此,多黏类芽孢杆菌菌剂可和化学肥料在玉米种植时一起作为基肥使用,可以减轻根腐病的发生,提高玉米产量,能够起到很好的减肥减药作用。

搅拌对多黏类芽孢杆菌发酵氧传递过程的影响及CFD模拟

以羧甲基纤维素钠水溶液(CMC)为液相,空气为气相,研究了不同桨型组合、体系黏度、气量、桨间距、气体分布器等对搅拌过程中氧传递的影响。结果表明:在CMC体系中,下层用径向流的涡轮斜叶桨、上层用轴向流的翼型桨有利于氧传递。当单位体积功率P/V≥1.5 kW/m3时,涡轮斜叶翼型组合桨(SRT-HI)比传统的双层透平组合桨(RT-RT)的传质系数提高约10%,且高径比越大,SRT-HI优势越明显。进一步用CFX11.0进行模拟,得到了不同桨型组合下气液两相的速率、气体和氧传质系数的分布等。并在50 L发酵罐中分别采用SRT-HI与RT-RT研究了搅拌对多黏类芽孢杆菌HY96-2发酵溶氧影响的热模实验,结果表明,在P/V=1.6 kW/m3条件下采用SRT-HI发酵,过程中体系的溶氧情况明显好于采用RT-RT时的溶氧情况。

牛类芽孢杆菌BD3526发酵麦麸抑制变形链球菌的特性

研究牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)BD3526抑制变形链球菌(Streptococcus mutans)ATCC35668的特性,拓宽P.bovis BD3526代谢产物的抑菌用途。主要研究P.bovis BD3526在麦麸培养基中的发酵特性和发酵上清液对蛋白水解酶和过氧化氢酶的敏感性、不同pH耐受性和热稳定性,以及对口腔中常见乳杆菌属生长的影响。结果表明,P.bovis BD3526发酵12 h后进入稳定期,在36 h时活性达到4.58×10^(8) CFU/mL、pH值5.20,对Streptococcus mutans ATCC35668抑菌圈直径为(21.27±0.71)mm。该发酵上清液对口腔中常见的有益菌(植物乳杆菌和干酪乳杆菌)无抑菌活性,但对链球菌属微生物抑制作用明显。目标抑菌物质具有良好的热稳定性和pH稳定性、对消化系统蛋白水解酶和过氧化氢酶不敏感;经链霉蛋白酶处理后抑菌活性消失,表明该抑菌物质的化学结构中含有肽类成分。P.bovis BD3526代谢麦麸合成的抑菌物质对S.mutans ATCC35668具有强烈抑制且稳定的抑制效果,这为将来开发特异性功能食品配料或口腔护理产品奠定了理论基础。

小麦内生多黏类芽孢杆菌hu-4产β-1,3-葡聚糖酶发酵工艺研究

对产β-1,3-葡聚糖酶小麦内生多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus Polymyxa)hu-4的产酶工艺进行了研究,通过正交实验建立和优化了hu-4菌株的发酵产酶培养基,确立了最佳发酵工艺.结果表明,以蛋白胨1.8%,酵母膏0.6%,玉米浆1.2%,酵母葡聚糖0.5%,矿质元素混合溶液0.5%为其最佳发酵培养基构成,pH值7.0;在温度32℃,转速200r/min,接种量2%的工艺条件下,发酵周期为36～38h,产酶效果较好.

1株桑叶内生生防多黏类芽孢杆菌可湿性粉剂的制备及应用效果

以筛选自健康桑树叶片的1株多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)为研究对象,通过单因素试验、正交试验结合生物相容性确定可湿性粉剂的最佳配方,探讨可湿性粉剂的促生效应和安全毒理性,在此基础上探索菌株促生和拮抗机制。结果表明,可湿性粉剂的最佳配方为发酵液70%、载体硅藻土10%、分散剂聚乙烯醇5%、湿润剂十二烷基苯磺酸钠10%、稳定剂磷酸钾2.5%、保护剂糊精2.5%。可湿性粉剂主要性能检测结果显示,菌含量约为7.0×10^(8) CFU/g,悬浮率为92.99%,湿润时间为20 s,细度为96.2%,pH值为6.8,含水量为1.81%。可湿性粉剂热稳定性较好,耐受弱酸弱碱环境。平板对峙试验结果表明,可湿性粉剂对桑青枯病病原菌5号小种和灰霉菌仍有较高的拮抗性能,灌根处理对番茄幼苗有明显促生效果。浸根和茎穿刺处理对番茄幼苗无害;经口灌胃试验小鼠表明可湿性粉剂低毒性,对雄性个体影响较小,对雌性个体的伤害较大。培养基定性分析结果显示菌株可产生铁载体,能产生有机酸、胞外纤维素酶和蛋白酶,从而直接或间接促进植物生长和抑制病原菌的生长。

内生多黏类芽孢杆菌对人参不同部位农药残留降解与皂苷单体累积的影响

为探究多黏类芽孢杆菌对人参不同部位农药残留及人参皂苷含量影响,通过气相色谱法、高效液相色谱法分别对人参内生多黏类芽孢杆菌处理前后人参不同部位农药残留及人参皂苷含量测定,比较其差异。结果显示:多黏类芽孢杆菌对5个部位农残降解率由大到小依次为芦头87.25%、须根69.87%、支根69.02%、木质部54.28%、韧皮部32.69%,对照组各部位农残降解率仅为7.58%~13.33%(P<0.05)。多黏类芽孢杆菌对人参各部位的9种人参皂苷加合值的含量累积效果由大到小依次为须根21.34%、芦头12.00%、支根9.03%、韧皮部8.60%、木质部8.18%(P<0.05)。结果表明,人参不同部位的农药残留与人参皂苷含量均有不同分布,多黏类芽孢杆菌对5个部位农残降解率以及9种人参皂苷的含量影响显著(P<0.05)。

牛类芽孢杆菌BD3526产抗菌物质培养条件的优化

为提高牛类芽孢杆菌BD3526在麸皮培养基中抗菌物质的产量,以藤黄微球菌为指示菌,抑菌圈直径为指标,分别考察了培养温度、培养时间、种龄、接种量以及麸皮浓度5个单因素对抗菌物质产量的影响。其中,培养温度、培养时间、接种量以及麸皮浓度4个因素对抗菌物质产量影响显著,故选取该4个因素进行响应面法优化。优化后的培养条件为:培养温度29℃、培养时间73h、接种量3.2%、麸皮浓度4.2%,在该条件下,BD3526抑菌圈直径为19.88mm,抑菌效价相对于优化前提高了100%。

牛类芽孢杆菌BD3526产α-葡萄糖苷酶抑制剂的条件优化

为了提高牛类芽孢杆菌BD3526发酵乳中α-葡萄糖苷酶抑制剂的产量,采用单因素实验和响应面法对发酵参数进行优化。BD3526合成α-葡萄糖苷酶抑制剂的优选参数为:培养时间43 h、培养温度29℃、脱脂乳质量浓度为5 g/100 g(水)、三角瓶装量为50 mL/250 mL。在此条件下,BD3526发酵乳对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度IC 50为15.1 mg/mL,与理论值(14.6 mg/mL)基本一致,比优化前(22.4 mg/mL)降低了33%。该研究为α-葡萄糖苷酶抑制剂的后续分离工作提供了保障,也为其他类似的研究提供了理论依据。

人参内生多黏类芽孢杆菌对农田人参生长和皂苷累积的影响

采用同时测定20种人参皂苷的高效液相色谱(HPLC)法评价人参内生多黏类芽孢杆菌对农田人参皂苷累积的影响,同时测定其对人参生长势和发病率的影响。结果表明,人参内生多黏类芽孢杆菌在喷施次数为5次时,人参根中20种皂苷含量之和可达1.5492%,人参茎叶中20种皂苷含量之和可达到8.7545%;人参内生多黏类芽孢杆菌喷施5次在促进农田人参皂苷含量增加的同时,对总株数、结果率、地上病情指数、地下病情指数、单株茎叶鲜质量、单株根鲜质量变化均具有正向影响,具体为地上病情指数、地下病情指数显著降低,其余生长指数显著提高。表明人参内生多黏类芽孢杆菌对农田人参生长和皂苷累积起着促进作用。

多黏类芽孢杆菌发酵液抑菌效果的研究

试验以多黏类芽孢杆菌为试验对象,以豆粕、麸皮、玉米粉、碳酸钙等为发酵培养基的主要成分,以家禽养殖生产中常见的3种有害菌(大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌)为目标菌,通过测定不同发酵时间发酵液的抑菌圈大小,研究发酵液的抑菌效果。结果表明:多黏类芽孢杆菌发酵液对3种目标菌的抑制效果为金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>沙门菌,且经加热处理后的发酵液抑菌效果更佳。

多黏类芽孢杆菌SWS-15玉米促生效果测定及其废水发酵条件优化

多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类具有植物促生效果和广谱抗菌性的细菌。为筛选促生效果明显的多黏类芽孢杆菌并实现菌剂制备,从好氧污泥中分离出1株多黏类芽孢杆菌SWS-15,通过玉米苗盘试验验证其促生效果,并应用Box-Behnken响应面优化利用粉丝厂废水发酵多黏类芽孢杆菌菌剂的条件。结果表明,菌株SWS-15发酵液中存在玉米素、赤霉素、生长素等促进植物生物的调节激素,多黏类芽孢杆菌SWS-15处理组的玉米株高和冠径相对于空白组均显著提高。响应面优化结果表明,在粉丝厂废水浓度为63.42%,初始pH值为7.85,温度为36.05℃时发酵24 h,可获得SWS-15菌剂的最大活菌数6.6×109 CFU/mL。因此,多黏类芽孢杆菌SWS-15发酵菌剂不仅可以有效促进玉米苗期生长,而且使粉丝厂废水实现资源化利用,具有开发应用的前景。