植物源物质诱导的斜纹夜蛾细胞凋亡

为了研究植物源物质对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体培养细胞系SL-1的凋亡诱导作用,采用倒置相差显微镜观察了印楝素、喜树碱等9种物质各自对SL-1凋亡小体的浓度效应及时序性。结果表明：印楝素0.1～5.0μg/mL和喜树碱0.5～20.0μmol/L处理SL-1,24～48h后均产生大量典型的凋亡小体;茶皂素、蓖麻碱、黄樟油、丹皮酚、烟碱、苦参碱和博落回碱0.1～20.0μg/mL处理SL-1后,整个观察期72h内均无明显凋亡小体出现,凋亡诱导作用不明显。印楝素0.75μg/mL诱导SL-1细胞凋亡,从凋亡小体判断,处理后0～36h属细胞凋亡早期,36～60h属细胞凋亡中期,60h后为细胞凋亡晚期。喜树碱5.0μmol/L诱导SL-1细胞凋亡,处理后0～24h属细胞凋亡前期,24～54h属细胞凋亡中期,54h后进入细胞凋亡晚期。初步认为印楝素和喜树碱对SL-1有凋亡诱导作用,并具有一定的浓度依赖性和时序性。

斜纹夜蛾核多角体病毒抑制苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒诱导的斜纹夜蛾细胞凋亡

野生型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)感染斜纹夜蛾 (Spodopteralitura)细胞系Sl zsu 1,可引起典型的细胞凋亡 ;但可以在草地夜蛾 (Spodopterafrugiperda)细胞Sf 9中复制并形成多角体 .比较了AcMNPV p35基因在病毒感染两种细胞的复制和转录情况 ,认为 p35在非受纳细胞中及时有效的表达能阻止细胞发生凋亡 ;共感染实验结果表明 ,斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)可以抑制AcMNPV诱导的细胞凋亡并可帮助病毒进行复制 ,推测SpltMNPV基因组中与 p35同源的 p4

抗苏云金杆菌毒素Cry1Ac粉纹夜蛾细胞系的特性研究

为了从离体细胞水平探讨昆虫对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的部分抗性机制,本文采用活化的Cry1Ac 毒素对粉纹夜蛾BTI-TN-581-4细胞连续筛选86代,获得了高水平抗性细胞,研究了其某些特性。它对Cry1c 产生了低水平的交互抗性,对低渗溶液的耐受性显著增强,双向电泳图谱表明抗性细胞膜蛋白组分发生了明显的变化。膜蛋白组分的变化可能导致了筛选细胞的耐低渗透压和抗Cry1C。

用DNA转染法研究小菜蛾颗粒体病毒在草地贪夜蛾细胞内复制

采用钙一磷沉淀技术将小菜蛾颗粒体病毒DNA转染草地贪夜蛾细胞,经转染120小时后的病变细胞核膨大,核内可见病毒粒子。回收转染5天后的细胞悬液,经破细胞处理,添食感染2龄小菜蛾幼虫,患病幼虫为典型颗粒体病毒病症状,感染率为37.8%。

斜纹夜蛾细胞的微载体悬浮培养

当微载体浓度３ｍｇ／ｍＬ、细胞接种浓度１．８０×１０５细胞／ｍＬ时，细胞培养８ｄ达最大生长密度１．２０×１０６细胞／ｍＬ，细胞群体倍增时间５６．２ｈ，葡萄糖的浓度随细胞培养时间的延续逐渐减小；氨的浓度随细胞培养时间的延续逐渐递增．

家蚕微孢子虫侵染家蚕胚胎细胞与草地贪夜蛾细胞的病变比较

家蚕微孢子虫(Nosema bom bycis)是引起家蚕微粒子病的病原,是一种无线粒体的专性细胞内寄生的原虫。将N.bom bycis经KOH处理后,接种于家蚕胚胎细胞(BmE细胞)和草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)。用倒置显微镜对微孢子虫在宿主细胞中感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察,比较两种细胞接种N.bom bycis后所出现的形态学变化。接种后第12天起,两种细胞内均充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动。在感染晚期,Sf21中有许多孢子从细胞中逸出,留下许多空泡,细胞还保持一定的完整性,而家蚕胚胎细胞则在感染后期完全崩解。这种差异可能是Sf21作为一种非原宿主细胞,对N.bom bycis的感染有一定耐受性有关。

水胺硫磷对草地贪夜蛾细胞亚显微结构的影响

经电镜观察表明：４００ｐｐｍ水胺硫磷药剂处理草地贪夜蛾细胞３０ｍｉｎ时，线体内膜上的嵴开始部分离解，细胞内空泡、囊泡明显增多，该药剂处理１ｈ后，细胞核周腔开始部分膨大，核膜部分离解；随着药剂处理时间的延长，线粒体内膜上的嵴渐渐消失，整个线粒体形成双囊体状结构，最后，有的线粒体解体．该药剂处理９ｈ后，部分细胞的核膜完全溶解，核质散追到细胞质中，上述结果表明，水胺硫磷不仅具有抑制昆虫体内乙酰胆碱酯酶（ＡｃｈＥ）的作用，而且还具有破坏昆虫细胞线粒体和核膜的作用．

虫螨腈对斜纹夜蛾细胞的毒力及对线粒体膜电位的影响

以MTT法测定了虫螨腈等杀虫剂对斜纹夜蛾（Spodoptera litura,SL）细胞的毒力,并用流式细胞仪测定了虫螨腈对SL细胞线粒体膜电位的影响。结果表明：100μg/mL的氟虫腈、丁醚脲、虫螨腈处理SL细胞24h后,对细胞增殖的抑制率依次为14.57%、22.91%、52.53%;虫螨腈对SL细胞24和48h的IC50值分别为57.56和2.60μg/mL;50、100、200μg/mL虫螨腈处理细胞24h后,与对照相比,SL细胞线粒体膜电位分别降低46.87%、57.17%、73.31%,其下降值与药剂浓度呈正相关。

Bt Cry1Ac抗性粉纹夜蛾离体细胞与敏感细胞mRNA的差异显示

为了研究昆虫对Bt的抗性机制 ,以苏云金芽孢杆菌Cry1Ac活性毒素对粉纹夜蛾离体细胞连续筛选 80代 ,获得了高抗性细胞。采用DDRT PCR技术比较了该抗性细胞与非选择敏感细胞mRNA的差异 ,经反向RNA斑点印迹杂交确证了 5个片段为两种细胞的显著差异表达序列标签(ESTs)。序列分析结果表明 ,敏感细胞特有的三种ESTs都位于cDNA的非编码区 ,两种ESTs(GenBank注册号 :S1 ,CF32 2 4 1 5 ;S3,CF32 2 4 1 7)与数据库中EST没有显著同源性 ,另一种S2(GenBank注册号 :CF32 2 4 1 6)与已登录的某些昆虫的ESTs具有一定的同源性。从抗性细胞特有的R1 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 3)推导出的氨基酸序列与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶有 60 %～63%的同源性 ,从抗性细胞特有的R2 (GenBank注册号 :CF32 2 4 1 4)推导出的氨基酸序列与黏蛋白类有约 30 %的同源性。这些差异表达基因可能与抗性的形成相关。

斜纹夜蛾核型多角体病毒DNA诱导同源昆虫细胞的凋亡

发现野生型斜纹夜蛾核型多角体病毒 (Spodopteralituranuclearpolyhedrosisvirus ,SpltNPV)DNA转染SL 1细胞能诱导细胞凋亡 .SpltNPV DNA转染其同源细胞系斜纹夜蛾核SL 1细胞 6h后 ,光镜下即可见细胞膜表面突出或形成小泡 ,细胞碎裂成凋亡小体 ,18h后 ,细胞 10 0 %碎裂成凋亡小体 .DAPI荧光染色显示感染细胞核渐呈半月形 ,直至碎裂被凋亡小体包裹 .被转染的SL 1细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型梯形谱带 .野生型SpltNPV病毒粒子感染的SL 1细胞既无多角体的出现 ,也无凋亡现象的发生 .

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬过程观察

观察微孢子虫在非天然宿主细胞系的生物行为过程,有助于探究微孢子虫的侵染特异性机制。选用鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系为材料,接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)孢子后观察其吞噬过程。结果发现:经氢氧化钾发芽预处理的Nb孢子虽然可以在Tn培养细胞液中发芽,但未见发芽孢子的孢原质进入Tn培养细胞;在接种Nb孢子浓度为2.0×105mL-1以上时,观察到孢子通过内吞作用进入了Tn培养细胞,但未见孢子的增殖;随着时间的延长和进入Tn培养细胞的Nb孢子的增加,可引起Tn培养细胞的超微结构变化,并导致细胞的裂解。以上结果说明,虽未见Nb以发芽形式感染Tn培养细胞,但Nb能够被吞噬进入Tn培养细胞并破坏其结构。

粉纹夜蛾培养细胞对家蚕微孢子虫的吞噬及与孢壁蛋白的关系

解明家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)入侵宿主细胞的相关因素,有助于深入研究Nb对家蚕的侵染机制。利用激光共聚焦显微镜观察Nb孢子接种粉纹夜蛾(Trichoplusiani,Tn)培养细胞48h后孢子的分布状态和培养细胞的生长情况,并对接种Nb孢子后的Tn培养细胞培养物总蛋白进行SDS-PAGE分析,证实经0.2mol/LKOH预处理的Nb孢子可以被Tn培养细胞所吞噬。对Nb孢子孢壁蛋白的SDS-PAGE分析显示,Nb孢子经KOH预处理后,大小为80kD和12kD的孢壁蛋白带缺失或明显减弱,30kD的孢壁蛋白带丰度降低。推测KOH预处理使Nb孢子部分孢壁蛋白被分解(部分或完全)或使蛋白结构发生变化,由此影响了Nb孢子与Tn培养细胞的相互作用关系,有利于Tn培养细胞对Nb孢子的吞噬。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。

辣椒碱对斜纹夜蛾细胞增殖及凋亡的影响

采用3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）检测法、荧光显微镜细胞形态观察法和流式细胞仪（flow cytometry,FCM）技术,研究了辣椒碱对离体培养斜纹夜蛾Spodopt-era litura（SL）细胞增殖及凋亡的影响。结果表明：辣椒碱对SL细胞24 h的IC50值为46.89μg/mL,与鱼藤酮差异不显著。40μg/mL辣椒碱处理SL细胞24h后,细胞形态明显不规则,呈现出凋亡的典型症状。10、20和40μg/mL辣椒碱处理SL细胞48h后,细胞早期凋亡率分别为13.56%、18.61%和3.81%,而晚期凋亡和坏死率分别为23.78%、34.28%和61.72%。辣椒碱处理细胞48h后,细胞周期变化明显,细胞生长阻滞于G2/M期。表明辣椒碱对斜纹夜蛾细胞具有良好的抑制作用,能致细胞凋亡并有一定的浓度依赖性。

杀菌剂对斜纹夜蛾SL细胞系和幼虫的生物活性

以MTT法筛选了19种杀菌剂对斜纹夜蛾Spodoptera litura SL细胞的毒杀活性,并以该方法研究了三唑类杀菌剂对SL细胞的毒力。结果表明：福美双、烯唑醇、己唑醇、氟硅唑、苯霜灵、苯醚甲环唑、戊唑醇和腈菌唑等杀菌剂对SL细胞具有优异的毒杀活性。三唑类杀菌剂腈菌唑、烯唑醇、己唑醇和戊唑醇处理SL细胞48h后,LC50值分别为21.94μg/mL、23.80μg/mL、33.16μg/mL和47.63μg/mL。以考马斯亮蓝G250法研究了腈菌唑对SL细胞中蛋白质含量和乳酸脱氢酶（LDH）漏出率的影响,20μg/mL腈菌唑处理12h、24h、48h和72h后,SL细胞中蛋白质含量分别降低8.55%、25.95%、42.95%和67.05%;处理24h和48h后,SL细胞的LDH漏出率分别为30.66%和32.05%。以浸叶喂食法处理斜纹夜蛾3龄幼虫,三唑类杀菌剂可显著抑制试虫体重增长。以0.5μg/头、1.0μg/头和2.0μg/头剂量的腈菌唑注射处理72h后,斜纹夜蛾4龄幼虫血细胞数量分别降低12.31%、25.96%和25.73%;腈菌唑注射处理48h和72h后,对斜纹夜蛾幼虫的LD50值分别为1.59μg/头和1.53μg/头。结果显示以离体培养细胞为对象,从现有杀菌剂中寻找新的杀虫剂先导化合物具有良好的研究潜力。

印楝素A对粉纹夜蛾Hi-5细胞的毒性机理

利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni Hbner卵细胞系（Hi-5细胞系）在细胞水平研究了印楝素（azadirachtin）A杀卵活性的毒性机理。以MTT法研究了印楝素A对粉纹夜蛾Hi-5细胞的生长抑制率,结果表明最初两天印楝素A对Hi-5细胞无较明显活性,但随后几天抑制率显著增加。用Giemsa染色法对细胞进行染色,观察细胞形态发生的变化,发现：1.25μg/mL印楝素A处理Hi-5细胞1d后,细胞已无法贴壁,形状变圆,接着细胞形态变得极不规则,有凋亡小体出现。用Ho33342染料对Hi-5细胞核DNA染色,通过荧光显微镜观察发现：经印楝素A处理后第1天,部分细胞核染色体发生异常凝聚,此后异常细胞核比例增多,核膜严重破损。以异硫氰酸荧光素（FITC）荧光染料研究了Hi-5细胞的蛋白质含量变化,发现1.25μg/mL印楝素A处理Hi-5细胞1d后,细胞蛋白质指数（DI）为1.070±0.018,至第3dDI值上升到1.912±0.019。分析了印楝素A处理后Hi-5的还原性谷胱甘肽（GSH）的相对含量变化,发现1.25μg/mL处理浓度下,各天处理组GSH抑制率有显著差异。结果显示印楝素A能够抑制Hi-5细胞增殖,影响细胞骨架正常功能,降低细胞活力。

Interruptin B对小菜蛾和亚洲玉米螟幼虫的拒食活性及对斜纹夜蛾卵巢细胞的毒力

为了研究Interruptin B的杀虫活性,初步探讨其杀虫作用机理,本研究采用叶碟法和叶片浸渍法测定了Interruptin B对小菜蛾Plutella xylostella和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis3龄幼虫的拒食活性和毒杀活性;采用注射法和血球计数法研究对斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫血细胞数的影响;采用四甲基偶氮唑盐[3-（4,5-dimethylthiazole-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法测定对斜纹夜蛾卵巢细胞（SL细胞）的增殖抑制作用;采用倒置显微镜观察对SL细胞形态、密度和贴壁率的影响。结果显示：处理后48h,Interruptin B对亚洲玉米螟和小菜蛾3龄幼虫的拒食中浓度（AFC50）分别为108.56和143.88μg/mL,致死中浓度（LC50）分别为346.23和194.32g/mL;处理后24h和48h,对SL细胞的抑制中浓度（IC50）分别为13.51和4.11g/mL。Interruptin B处理SL细胞后12-48h,细胞密度随时间的延长而下降,与对照差异显著（P〈0.05）;处理后3,6,12,24和48h,SL细胞变形率分别为28.18%,83.90%,85.18%,93.93%和100%,细胞贴壁率分别为96.59%,89.90%,83.18%,5.06%和1.09%,处理后6-48h,SL细胞变形率和贴壁率与对照差异显著（P〈0.05）。Interruptin B对小菜蛾和亚洲玉米螟3龄幼虫具有良好的拒食和毒杀活性,能显著降低斜纹蛾幼虫血细胞数量,对SL细胞具有良好的增殖抑制作用,可显著降低SL细胞生长密度,改变细胞形态,降低贴壁率,表明该化合物可通过影响昆虫细胞活力毒杀活体昆虫。

吖啶橙对草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒的损伤效应

背景与目的:探索吖啶橙对昆虫细胞的遗传损伤。材料与方法:用不同浓度的吖啶橙处理草地贪夜蛾Sf9细胞、AcMNPV病毒,观察其对细胞生长发育,微核发生率,AcMNPV感染力的影响。结果:sf9细胞经5μg/ml的吖啶橙处理后,细胞分裂生长速度减慢,细胞表面粗糙,微核发生率为10.4‰,10μg/ml时可引起细胞膜破碎或死亡,微核发生率为22‰,出现三核,多核甚至核裂现象。当AcMNPV经吖啶橙处理后再感染sf9细胞,AcMNPV可在细胞内增殖,形成多角体,并出现一些类似三角形或四角形的异常多角体。结论:用一定剂量的吖啶橙处理草地贪夜蛾sf9细胞和AcMNPV病毒,可对细胞产生损伤和引起AcMNPV发生异常多角体。

植物精油对鱼藤酮和辣椒碱在斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1中活性的影响

应用流式细胞术研究了24种常用植物精油对斜纹夜蛾Spodoptera litura离体培养细胞系(SL-1)细胞膜通透性的影响,采用MTT法研究精油对2种植物源农药鱼藤酮和辣椒碱的细胞活性的影响.试验结果表明:与对照相比,50μg·mL-1芸香油处理SL-1细胞24 h后,细胞内荧光染料碘化丙啶(PI)的荧光强度增加了53.04%,其次是松节油和当归油,细胞内PI荧光强度分别增加了34.23%和33.67%;100μg·mL-1广藿香油、松节油、芸香油、当归油、香茅油、生姜油处理SL-1细胞后,细胞内PI荧光强度增加率超过40%.鱼藤酮和辣椒碱对SL-1细胞的抑制中浓度(IC50)分别为34.97和35.92μg·mL-1,而与100μg·mL-1芸香油联用时IC50分别为12.69和13.26μg·mL-1,与100μg·mL-1松节油联用的IC50分别为14.56和11.392μg·mL-1,均小于鱼藤酮和辣椒碱单剂用量,芸香油、松节油能够显著提高鱼藤酮和辣椒碱对SL-1细胞的细胞活性.

血啉甲醚对斜纹夜蛾SL细胞的氧化损伤

通过研究血啉甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether,HMME）对斜纹夜蛾Spodoptera litura（SL）细胞的增殖抑制率IC50、处理后细胞内丙二醛（malondialdehyde,MDA）的生成量、细胞内还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平和细胞器超微结构的变化,明确血啉甲醚对SL细胞的氧化损伤,并探讨将血啉甲醚及其衍生物拓展应用到农业害虫防治领域的可行性。用MTT法测定血啉甲醚光照处理下对SL细胞24h和48h的IC50值分别为8.35μg/mL和7.66μg/mL。硫代巴比妥酸（TBA）法测定表明,血啉甲醚光活化后能导致胞内MDA含量明显升高,且MDA的生成量与其浓度呈正相关;当血啉甲醚浓度为50.000μg/mL,光照处理48h时,细胞内MDA生成量达到173.08±3.51nmol/L。5,5′-二硫代双-（2-硝基）苯甲酸（DTNB）法对处理后细胞内GSH水平测定结果表明,光活化后的血啉甲醚处理SL细胞能导致细胞内还原型GSH相对含量随血啉甲醚浓度升高而显著降低;当血啉甲醚浓度为50.000μg/mL,处理48h时,光照处理组细胞内GSH相对含量较之同浓度黑暗处理下降了39.59%。扫描电镜观察显示,6.250μg/mL的HMME处理细胞并光照后,细胞膜表面出现了明显的孔洞,有的细胞出现了花样皱褶和内陷。这些结果表明在血啉甲醚的试验剂量下,SL细胞受到了氧化损伤。