夜蛾颗粒体病毒宿主筛选及其增殖因子主次研究

夜蛾颗粒体病毒(GXW9-3 Mamestra oleracea granulosis virus)简称MOGV GXW9-3。该病毒2013年首次由高小文在江苏镇江发现,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:V201340,样品呈黑色粉末状,保存于4℃冰箱。MOGV GXW9-3是寄生在鳞翅目夜蛾科昆虫真皮、脂肪组织及血细胞中的一种最重要的杆状病原病毒,以蛋白质包涵体的形式存在,蛋白质包含着一个病毒颗粒,核酸为双链DNA。本文研究影响MOGV GXW9-3增殖宿主及增殖因子的主次,筛选该病毒增殖最佳宿主及其增殖因子主次。研究结果表明,影响MOGV GXW9-3产量的因子及互作因子主次顺序为:宿主细胞 > 饲毒虫日龄与收毒时间互作 > 饲毒虫日龄与收毒时间互作 > 收毒时间 > 温度。明确饲毒宿主,饲毒虫日龄因子对病毒产量有极显著影响,饲毒虫日龄和饲毒虫日龄与收毒时间存在互作且对产量有显著影响。确定MOGV GXW9-3增殖宿主为斜纹夜蛾细胞,最佳生产条件为26~28℃、分别按药剂浓度为:6 × 106 GV/mL、4 × 106 GV/mL、3 × 106 GV/mL、2.4 × 106 GV/mL、2 × 106 GV/mL的剂量饲毒斜纹夜蛾6龄幼虫,14~16 d后提取病毒,斜纹夜蛾6龄幼虫平均单虫个体重约1.046 g,冷冻干燥后每头虫体重量约为:0.085~0.108 g,平均单虫病毒产量约为0.069~0.28亿GV/g,幼虫孵化到收集幼虫提取病毒的生产周期为24 d,病毒增殖倍数为:31.25~43.75倍。

粉纹夜蛾颗粒体病毒增效基因3′端2.5kb片段在大肠杆菌中的表达

将粉纹夜蛾Trichoplusiani颗粒体病毒增效基因 3′端 2 5kb片段插入 pQE 31中构建了重组表达载体 pQE/enhancin ,转化大肠杆菌M 15( pREP4 )在IPTG诱导下成功表达出分子量约为96kD的融合蛋白并命名为P96。初步纯化的P96显示了明显的增效活性 ,可提高棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫 3龄幼虫感染死亡率 2 7 4 0 %～ 34 50 % ,缩短LT50 1

粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白的增效作用

采用时间 剂量 死亡率模型 ,分析了粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)颗粒体病毒重组增效蛋白P96对棉铃虫 (Helicoverpaarmigera)核型多角体病毒 (HaNPV)感染棉铃虫幼虫的增效作用。结果显示 :感染后 11d ,HaNPV +P96组的LC50 值为 3.4 7× 10 3 多角体 /mL ,比HaNPV组 ( 3.89× 10 4 多角体 /mL)降低了 91.0 8% ;在 1.6× 10 4 ～ 1.6× 10 6多角体 /mL浓度范围内 ,HaNPV +P96组的LT50 值较HaNPV组缩短 0 .3～ 1.8d。

粉纹夜蛾颗粒体病毒全长增效基因在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术扩增了粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)颗粒体病毒增效基因全长片段,扩增产物用EcoRⅠ/HindⅢ双酶消化,经0.7%低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化后插入pRSET-B中,得重组表达质粒pRSET/enhancin;但重组子生长异常,在IPTG诱导下未能明显表达目标蛋白.用PstⅠ/HindⅢ双酶消化pRSET/enhancin,电泳回收2.7kb片段后插入pQE-30中,得重组表达载体pQE/enhancin;在IPTG诱导下于35℃成功表达出分子量(Mr)约为108×103的融合蛋白并命名为P108.初步纯化的P108显示了极显著的增效活性,对棉铃虫核型多角体病毒感染棉铃虫3龄幼虫的7d致死率提高34.03%,LT50缩短1.4d;对苏云金杆菌杀棉铃虫3龄幼虫的72h致死率提高65.96%.

110亿OB/mL夜蛾颗粒体病毒悬浮剂对斜纹夜蛾的田间药效试验

生物农药110亿OB/mL夜蛾颗粒体病毒SC是镇江市润宇生物科技开发有限公司新研发的生物杀虫剂。为探索该产品对斜纹夜蛾田间防效,为产品登记提供依据,特进行了该产品的田间小区、大区药效试验。试验结果表明,生物农药110亿OB/mL夜蛾颗粒体病毒SC对斜纹夜蛾的防治效果较好,每公顷用量1500~2500mL平均防效达80%~90%,可在十字花科蔬菜斜纹夜蛾的防治中推广应用。

昆虫病毒重组增效蛋白的广谱增效活性

室内生物测定表明 ,大肠杆菌表达的粉纹夜蛾颗粒体病毒重组增效蛋白P96可显著或极显著提高棉铃虫核型多角体病毒、苏云金杆菌和阿维菌素对棉铃虫幼虫的致死率 ,分别提高1 6 9.78%、73.90 %和 36 .0 4 % ;对苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒感染甜菜夜蛾幼虫也有明显增效作用。Na2 CO3 溶解的P96对棉铃虫初孵幼虫有一定致死作用。