云木香内生细菌的分离鉴定及其对大丽轮枝菌的抑制作用

从药用植物云木香中分离得到41株内生细菌,采用细菌16S rRNA基因测序的方法对这些菌株进行鉴定,结果显示,这些云木香内生细菌分别属于6个属,其中假单胞菌属Pseudomonas和拉恩氏菌属Rahnella为优势菌属。采用对峙培养方法对这些菌株进行筛选,发现其中12株内生细菌对大丽轮枝菌Verticillium dahliae具有抑制作用,其中有2株属于拉恩氏菌属Rahnella,7株属于假单胞菌属Pseudomonas,3株属于沙雷氏菌属Serratia。12株内生细菌对棉花黄萎病的温室防效评估结果表明,假单胞菌属菌株R1-6、R1-13和S1-2对棉花黄萎病的温室防效达到55%以上,具有潜在的生产利用价值。

外源添加铁离子对向日葵大丽轮枝菌生物学特性及致病力的影响

为了探究铁离子对向日葵大丽轮枝菌生物学特性及致病力的影响,在培养基中外源添加铁离子后,对大丽轮枝菌的生长速度、产孢量、微菌核数量、粗毒素分泌量、细胞壁降解酶活性以及致病力进行了测定。结果表明,外源添加不同浓度的铁离子后,菌丝的生长速度和产孢量均呈现出递增趋势,相比对照,添加80μmol/L的铁离子后大丽轮枝菌的生长速度最快,菌落直径为68.81 mm,增长率为21.40%;产孢量为2.58×10^(7)个/mL,增长率为21.13%;微菌核数量也随着外源添加铁离子浓度的增加而增多,在培养5 d后,相比对照,其涨幅为51.53%;粗毒素分泌量在添加80μmol/L的铁离子后,增幅近1倍;细胞壁裂解酶活性随着外源铁离子浓度的增加而增强,并在80μmol/L时达到最强。此外,随着培养基中铁离子浓度的增加,大丽轮枝菌的致病力也相应增强,表现在当外源添加的铁离子浓度由0μmol/L增加至80μmol/L时,病情指数由35.00提高至62.20,增长率为77.71%。综上所述,外源添加铁离子不仅能够加速大丽轮枝菌的生长,促进产孢和微菌核的形成,还能够增强大丽轮枝菌的致病力。

抗病蛋白CkPGIP1关键氨基酸突变增强对大丽轮枝菌的抑制作用

牛心朴子草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(CkPGIP1)能有效抑制大丽轮枝菌多聚半乳糖醛酸酶(VdPG1)的活性,为了进一步提高CkPGIP1的抗病性,本研究从CkPGIP1定点突变入手,研究其突变增强对大丽轮枝菌的抑制作用。通过重叠延伸聚合酶链式反应(PCR)成功构建了CkPGIP1蛋白突变体T152VCkPGIP1、D202SCkPGIP1和I250KCkPGIP1,构建原核表达载体对CkPGIP1及其突变体进行体外诱导表达和纯化,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法和琼脂糖径向扩散法测定突变蛋白对大丽轮枝菌VdPG1的抑制作用。DNS法测定结果表明:突变蛋白能有效抑制VdPG1活性,且呈剂量依赖性,其中,D202SCkPGIP1对VdPG1的抑制效果显著,T152VCkPGIP1抑制效果次之,I250KCkPGIP1抑制作用不明显。琼脂糖径向扩散结果与DNS法的一致,其中经D202SCkPGIP1处理的VdPG1扩散直径缩小最多,表明其抑制活性最为显著。进一步研究发现,突变蛋白可以抑制大丽轮枝菌在棉花叶片上的扩展,进一步证实CkPGIP1关键氨基酸突变增强了对大丽轮枝菌的抑制作用。

大丽轮枝菌果胶裂解酶PL1家族基因VdPL1-4的致病功能研究

大丽轮枝菌Verticillium dahliae引起的黄萎病是一种传播迅速且为害广泛的土传维管束真菌病害。大丽轮枝菌分泌的水解酶在侵染中发挥重要作用,尤其是纤维素酶和果胶酶。大丽轮枝菌果胶裂解酶包括PL1、PL3、PL4、PL9和PL11 5个家族,其中PL1家族成员数目最多,但对该家族的致病功能还未见系统研究。本研究明确大丽轮枝菌PL1家族共包含17个成员,且多数成员在侵染早期上调表达,其中VdPL1-4和VdPL1-8在侵染早期强烈诱导表达。挑选VdPL1-4构建缺失突变体,发现VdPL1-4缺失后菌株对棉花的致病力显著下降,对复杂碳源(果胶、羧甲基纤维素、淀粉)的利用能力受限,该基因回补后菌株的毒力和碳源利用能力均得以恢复。信号肽介导的分泌活性验证表明VdPL1-4为分泌蛋白。以上研究表明,VdPL1-4是重要毒力因子,研究结果为后续系统解析果胶裂解酶在病原致病过程中发挥的作用提供了理论依据。

海岛棉CAD和CAD-Like基因家族的鉴定、表达及其对大丽轮枝菌的响应

【目的】肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素合成途径中的关键酶,在增强植物机械强度、抵御病原菌入侵等方面发挥重要作用。鉴定海岛棉GbCAD、GbCAD-LIKE(GbCADL)基因家族成员,并对其表达特征及其在黄萎病抗性中的作用进行分析,为棉花抗黄萎病机制的解析及抗病育种提供参考。【方法】利用生物信息学方法对海岛棉GbCAD、GbCADL基因家族成员进行鉴定,并对其染色体定位、系统发育关系、基因结构、启动子顺式元件的预测进行系统分析。通过获得公开释放的转录组数据和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析GbCAD基因及GbCADL基因的表达特征。利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术对GbCAD基因及GbCADL基因进行功能分析。【结果】从海岛棉中鉴定到25个GbCAD基因(分布在10条染色体)和34个GbCADL基因(分布在17条染色体)。GbCAD基因分为3个亚组,GbCADL基因分为4个亚组,同一个组内基因含有相似的外显子-内含子结构和保守结构域。GbCAD基因和GbCADL基因具有不同的转录表达特征,其启动子中含有多种激素和胁迫响应元件。转录组数据和qRT-PCR显示,GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL5A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达受大丽轮枝菌诱导,尤其是GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达在大丽轮枝菌处理后显著增加。利用VIGS技术,将显著受大丽轮枝菌诱导表达的GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D分别在棉花中沉默,分析VIGS株系对大丽轮枝菌抗性的变化。结果显示,与对照植株相比,VIGS株系对大丽轮枝菌的抗性显著降低。二氨基联苯胺(DAB)染色结果显示,在未受到黄萎病侵染时,VIGS植株和对照植株的染色程度无显著差异;在大丽轮枝菌处理6 h后,与对照植株相比,沉默株系GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D均表现出较深的着色,表明在沉默株系中有较高的活性氧累积。茎的切片结果显示,大丽轮枝菌处理后,TRV:GbCAD10A/D、TRV:GbCADL4A/D、TRV:GbCADL6A/D、TRV:GbCADL7A/D沉默株系的茎维管组织表现出明显的深褐色,表明其对大丽轮枝菌的抗性显著降低。【结论】抑制GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D、GbCADL7A/D的表达可以显著降低棉花对大丽轮枝菌的抗性。

拮抗细菌KRS022的鉴定及对大丽轮枝菌的抑制效果

【目的】明确拮抗细菌KRS022的分类地位及对多种病原真菌的抑制作用,重点研究对作物黄萎病的防治效果及其对病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的抑制效果,为抗大丽轮枝菌生防制剂的研发提供资源。【方法】通过形态学、生理生化试验及16S rDNA与gyrB基因序列串联分析确定KRS022的分类地位;采用对峙培养法和对扣熏蒸法测试KRS022对多种真菌的抑制作用;采用发酵菌液平板法、涂布法以及对扣熏蒸法明确KRS022对大丽轮枝菌的平板抑制效果;通过无细胞上清共培养法与对扣熏蒸法明确KRS022对大丽轮枝菌孢子萌发及菌丝形态的影响;通过盆栽试验及大丽轮枝菌生物量测定明确KRS022对棉花和烟草黄萎病的防治效果;利用RT-qPCR法检测KRS022激发植物免疫相关基因的表达特性。【结果】拮抗菌株KRS022为革兰氏阴性细菌,鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。该菌株具有解磷、解钾、固氮功能,可产生嗜铁素,具有蛋白酶、淀粉酶、过氧化氢酶活性,属于好氧产碱型细菌,100μg·mL^(-1)氨苄青霉素可作为该菌株的天然抗性筛选条件。KRS022对多种病原真菌(大丽轮枝菌、尖镰孢、禾谷镰孢、稻瘟病菌、灰葡萄孢、胶孢炭疽菌、果生炭疽菌)均具有不同程度的抑菌活性,对峙和对扣培养对大丽轮枝菌Vd991的抑制率分别达75.19%和99.78%。发酵菌液平板法、涂布法以及对扣熏蒸法对大丽轮枝菌的抑制率分别为96.21%、99.72%和99.44%,均能显著抑制Vd991菌丝生长;KRS022无细胞上清液与大丽轮枝菌分生孢子共培养完全抑制孢子萌发,对扣熏蒸后Vd991菌丝发生膨大、变粗。室内盆栽试验结果表明KRS022能够显著抑制棉花和烟草黄萎病的发生,并发现对植株具有促生作用,与清水处理的烟草盆栽相比,施用KRS022菌液的烟草盆栽的叶维度及单叶面积增幅分别达65.7%和146.4%;施用KRS022菌液后大丽轮枝菌在植株中的生物量显著减少,棉花和烟草对照组(单独接种Vd991)中大丽轮枝菌的生物量分别是处理组(KRS022+Vd991)的1.75和2.57倍。同时KRS022能够激发植物防御反应相关基因的表达,经KRS022处理的棉花植株中水杨酸(SA)通路标记基因GhPR1、茉莉酸(JA)通路标记基因GhAOC4和乙烯(ET)通路标记基因GhEIN2均显著上调表达,上调倍数分别是清水处理的7.23、1.69和15.05倍;经KRS022菌液处理后再接种大丽轮枝菌的棉花植株,GhAOC4和GhEIN2被显著诱导表达,上调倍数分别是只接种大丽轮枝菌的68.09和11.87倍;经KRS022无细胞上清液注射处理后NbHSR203、NbHIN1、NbPR1、NbPR2、NbPR5、NbRbohA、NbRbohB上调表达倍数分别是空白LB处理的1.98、2.79、2.52、1.25、1.70、3.28、3.44倍,均显著上调表达。【结论】拮抗细菌KRS022鉴定为产碱假单胞菌,能够产生铁载体,具有解磷、解钾、固氮并促进植物生长的潜力。对多种病原真菌均具有抑制效果,能够抑制大丽轮枝菌菌丝生长及孢子萌发,具有防治黄萎病及激发植物免疫反应的作用,是一株具有开发前景的防治黄萎病等真菌病害的生防微生物资源。

大丽轮枝菌(Verticillim dahliae)突变体库的构建与分析

为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得13030多个阳性转化子,随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析,发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明,该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1528782 bp处,属于内切葡聚糖酶1基因(VDAG_04017)。综上所述,本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段,可初步鉴定病原菌致病相关基因,为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。

科学家研究揭示M35家族金属蛋白酶调控大丽轮枝菌毒力的作用机制

中国农业科学院棉花研究所棉花病害防控与风险评估创新团队研究发现了两个大丽轮枝菌M35家族金属蛋白酶VdM35-1和VdASPF2,并揭示了其通过调控大丽轮枝菌产孢、菌丝生长、孢子形态及碳源利用等,调节大丽轮枝菌的适应性和毒力,为进一步阐明大丽轮枝菌的致病机理提供了理论基础。相关研究结果发表在《微生物学波普》上。

0.4%大丽轮枝孢激活蛋白在水稻上的应用效果

为明确0.4%大丽轮枝孢激活蛋白在水稻上的应用效果,本研究通过使用0.4%大丽轮枝孢激活蛋白分别进行水稻浸种和叶面喷施试验,研究其对水稻生长、抗病和产量的影响。水稻浸种试验表明,0.4%大丽轮枝孢激活蛋白对水稻苗期生长性状均有一定的促进作用,提高秧苗质量,增产达7.57%,优于3%极细链格孢激活蛋白;叶面喷施试验表明,破口期使用0.4%大丽轮枝孢激活蛋白能够提高水稻抗病性,平均综合防效达73.45%,产量提高10.40%,较3%极细链格孢激活蛋白平均综合防效提高16.14%、产量增加3.00%。综上所述,水稻使用0.4%大丽轮枝孢激活蛋白进行浸种或破口期叶面喷施均可改善其产量性状,进而增加产量,为其在水稻上的大面积推广应用提供依据。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae VdLs.17)分泌组预测及分析

【目的】预测并分析大丽轮枝菌基因组范围内的分泌蛋白,为大丽轮枝菌分泌蛋白致病机理的研究奠定基础。【方法】利用已公布的大丽轮枝菌全基因组序列,组合使用生物信息学软件SignalP、TargetP、TMHMM、Big-pi和PROSITE,预测大丽轮枝菌基因组范围内所有分泌蛋白,定义为分泌组。统计分析分泌组中蛋白N-端信号肽特点;应用碳水化合物活性酶类数据库和病原菌-寄主互作蛋白数据库对分泌组蛋白进行注释,预测分泌组中潜在果胶酶、纤维素酶和病原菌寄主互作蛋白;利用真菌激发子的保守结构域,预测分泌组中潜在的激发子蛋白集;应用BLASTP程序比较分析大丽轮枝菌和黑白轮枝菌分泌组,获得大丽轮枝菌相对于黑白轮枝菌特异的分泌蛋白。【结果】大丽轮枝菌分泌组共有922个蛋白。信号肽分析表明,以19个氨基酸为信号肽的蛋白数目最多,非极性氨基酸丙氨酸的出现频率最高,而有带电侧链的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的出现频率最低,信号肽的-3和-1位置上的氨基酸相对保守。大丽轮枝菌分泌组含有158个潜在的碳水化合物活性酶类,其中,包括10个果胶水解酶和14个果胶裂解酶;190个潜在的病原菌-寄主互作蛋白、97个含有RxLx[EDQ]模体的蛋白和52个富含半胱氨酸的小分子量分泌蛋白;58个相对于黑白轮枝菌分泌组特异的蛋白。【结论】本文建立了预测大丽轮枝菌分泌组蛋白的方法。分泌组蛋白信号肽长度具有高度的变异性,氨基酸组成多为脂肪族氨基酸,序列在C-端结构域较为保守。分泌组中包含大量潜在的果胶降解酶、病原菌-寄主互作蛋白、RxLx[EDQ]模体蛋白和富含半胱氨酸的小分子量蛋白等致病相关蛋白。

大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的棉花黄萎病,是一种危害严重的世界性病害。通过初筛和复筛得到了对棉花黄萎病具有较高拮抗活性的细菌菌株12-51,通过对其进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16SrDNA全序列分析,最终鉴定此菌株为Bacillus velezensis,16SrDNA序列相似度达99.74%。采用有机溶剂萃取和盐析法对发酵产物进行了提取,初步断定拮抗物质为蛋白类。通过对粗蛋白进一步研究发现,60%组分活性较高,并且对热及酸碱敏感性较小。试验结果为棉花黄萎病的生物防治奠定了基础。

大丽轮枝菌拮抗细菌枯草芽孢杆菌12-34菌株发酵产抗菌蛋白的条件优化

采用单因素试验及正交试验结合的方法,优化大丽轮枝菌拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)12-34菌株产抗菌蛋白的发酵条件。通过单因素试验和正交试验,确定了B.subtilis12-34菌株产抗菌蛋白的适宜碳源、氮源和无机离子,优化了培养基的组成;并对B.subtilis12-34菌株产抗菌蛋白的发酵时间、装瓶量、接种量、培养基初始pH、摇床转速和发酵温度进行了优化。结果显示,B.subtilis12-34菌株产抗菌蛋白的最佳培养基组成为玉米粉5%,牛肉浸膏3%,CaCl20.10%,KCl 0.05%;B.subtilis12-34菌株产抗菌蛋白的最佳发酵条件为培养基初始pH9.0,种子液按10%接种量接种至50 mL/250 mL三角瓶中,200 r/min,37℃培养48 h。优化后表征抑菌蛋白产量的抑菌圈直径增大了115.5%。

大丽轮枝菌拮抗芽孢菌株的分离、鉴定及两株菌抑菌特性研究

从新疆和硕连作棉田根际土壤中分离到146株芽孢细菌.29株对大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)具有拮抗作用的菌株中有9株拮抗性极强.经鉴定,9株拮抗性极强的菌株中有2株属短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),7株与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)相近.抑菌特性实验表明:J-02和J-15的抑菌高峰分别出现在衰亡期和稳定期,对pH的耐受范围分别为5~9和7~9;J-02的热稳定性较好,J-15对温度较敏感,但100℃处理后仍有抑菌活性;J-02能够抑制大丽轮枝菌芽管伸长形成菌丝,J-15可导致大丽轮枝菌菌丝畸形,失去产孢能力.盆栽实验表明,J-02和J-15这2株拮抗菌对棉花黄萎病有明显防治作用.综合结果表明J-02和J-15均有作为棉花黄萎病生防菌的潜能.

棉田大丽轮枝菌微菌核的空间分布及其抽样技术

大丽轮枝菌可侵染660多中植物，由其引致的黄萎病具有危害性大、难于防治等特点。微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和初侵染源，研究其在土壤中的分布特征及抽样技术，对于准确预测黄萎病的发生为害状况具有重要意义。土壤微菌核调查结果表明，在0～20cm土壤中，微菌核主要呈聚集或均匀分布，随密度而变化。建立的理论抽样数模型为：n=1．4679（t／D）2m-1.2604。利用得到的棉田土壤大丽轮枝菌微菌核调查的序贯抽样模型计算，最多只需抽取35个样点。对各等距机械抽样方法比较后，认为实际中用双对角线取样比较合适，取样数量因土壤中微菌核的密度而异。

农杆菌介导转化大丽轮枝菌的体系优化

为了揭示大丽轮枝菌的遗传变异和致病机理,以含潮霉素为抗性筛选标记、绿色荧光蛋白GFP为报告基因载体,优化了农杆菌介导转化大丽轮枝菌的遗传转化体系,获得了大丽轮枝菌菌株V991和BP2含绿色荧光蛋白GFP的转化子,转化率达到100×10-6～550×10-6。优化的转化条件为:农杆菌以IM液体培养基调节浓度至OD600=0.2并预培养4 h,然后与等体积的浓度为106个.mL-1的大丽轮枝菌孢子混匀,每皿取200μL混合液涂于固体IM共培养基的纤维素膜上,25℃共培养60 h,转移至固体PDA培养基上以头孢噻肟钠500mg.L-1+潮霉素B 50 mg.L-1进行筛选。研究发现农杆菌LBA4404和AGL-1比农杆菌SK1044和EHA105更适用于大丽轮枝菌转化。对转化子观察和鉴定发现:从表型上,70.8%转化子保持野生型形态,29.2%转化子发生了形态变化;从致病力上,81%转化子的致病力相对于野生型没有发生显著变化,19%转化子的致病力或增强或减弱。

大丽轮枝菌拮抗细菌8-52菌株的筛选与鉴定

为筛选对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)具有拮抗作用的芽孢细菌,采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛从各地的土样中分离到83株拮抗细菌菌株,对其中的69株进行了复筛,得到一株具有较强的抑菌活性的拮抗细菌8-52菌株。对该菌株进行了形态特征的观察、生理生化试验和16S rDNA的序列分析。将该菌株的形态特征和生理生化特性鉴定的结果与相应种、属模式菌的性状相对照,认为菌株8-52与芽孢杆菌(Bacillus)的相应性状很相近。根据16S rDNA序列相似性分析,此菌株与Bacillus velezensis标准菌株AB245422的16S rDNA序列相似度达99.78%,因此鉴定拮抗菌株8-52为Bacillus velezensis。

大丽轮枝菌分泌蛋白激发子的分离纯化及生物功能研究

利用硫酸铵沉淀、KTA explorer 10蛋白纯化仪、非变性电泳、割胶电洗脱等方法,从大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)发酵液中分离纯化出一种蛋白激发子,经SDS-PAGE电泳检测单一条带,相对分子量为20 kD。该蛋白激发子能够诱导烟草的过敏反应,处理6 h后,处理部位出现水渍状,24 h后出现坏死斑。该激发子可以诱导烟草细胞在较短时间内产生防卫反应信号分子H2O2和NO,并引起活性氧爆发。

几种氨基酸铜对大丽轮枝菌产生毒素蛋白的影响

用几种氨基酸铜溶液处理大丽轮枝菌,阴离子交换层析分离培养液中的毒素蛋白,并进行棉苗的致萎实验,比较了各氨基酸铜制剂对大丽轮枝菌毒素蛋白产生的影响。实验表明,丙氨酸铜、甘氨酸铜、谷氨酸铜和复合氨基酸铜都在一定程度上抑制了大丽轮枝菌微菌核的形成和毒素蛋白的分泌,而苏氨酸铜促进了毒素蛋白的分泌。说明复合氨基酸铜的抑菌作用是各成分协同作用的结果。

植物内生及根际土壤细菌诱导棉花对大丽轮枝菌抗性的研究

本研究在分离植物组织内生菌及根围土壤细菌的基础上,进行了室内拮抗活性测定,进而进行诱抗效果的检测。来自植物组织内部的细菌群落中含拮抗性较强的细菌群体较大。在拮抗群体中,经诱导,68.42%菌株获得了抗 Rif 300×10^(-6)的突变体。抗利福早突变体菌株在培养性状、室内拮抗性及诱导抗性等方面,与原菌株均十分相似。以菌株73a 诱导抗性效果较好,达67.21%。诱抗效果与细菌在体内定殖与运转能力密切相关。