大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的 探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶 (PO)与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法 以大劣按蚊 /约氏疟原虫模型 ,利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法 ,比较、分析血餐后 5、7、11、15d时不吸血组、吸正常血组和感染组 3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶 (MPO)和双酚氧化酶 (o DPO)活性 ;同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果 感染组的血淋巴MPO和o DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组 (P <0 .0 5 ) ;但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高 ,感染组血淋巴MPO和o DPO活性逐渐下降。另外 ,吸正常血组的MPO和o DPO酶活性明显高于不吸血组 (P <0 .0 5 )。结论 吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应 。

致倦库蚊及大劣按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性测定

目的掌握海南省致倦库蚊和大劣按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性发生及发展趋势。方法采用幼虫浸渍法,测定其对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性倍数。结果五指山市、澄迈县和海口市的致倦库蚊对溴氰菊酯抗性倍数分别为7.50、6.67、8.00倍,对氟氯氰菊酯的抗性倍数分别为5.31、6.00、6.23倍;琼中县大劣按蚊对溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的抗性倍数分别为1.12和1.31倍。结论海南省致倦库蚊对这2种拟除虫菊酯类杀虫剂均产生了低抗药性;而大劣按蚊尚未产生。

云南大劣按蚊生态习性、地理分布和传疟作用研究

目的：观察云南大劣按蚊的生态习性、地理分布及其传疟作用。方法：现场调查、人诱等。结果：幼虫的主要滋生地为小型积水。成蚊以野栖性为主，野外诱捕率占８０％以上。人、牛诱捕量的比例为２１．５∶３，表明偏嗜人血。其季节消长与当地疟疾发病曲线相吻合。该蚊唾腺疟疾感染率为０．２９％。结论：该蚊是云南北纬２３．８°以南，海拔１０００ｍ以下热带森林与次森林地区重要的传疟媒介。

用聚合酶链反应区分我国大劣按蚊复合体A和D种

目的：建立一种鉴别大劣按蚊复合体Ａ和Ｄ种的ＰＣＲ检测技术。方法：根据大劣按蚊Ａ和Ｄ种核糖体ＤＮＡ第二内转录间隔区的序列差异，设计种特异引物，通过ＰＣＲ扩增出种特异长度（Ａ种为３７４ｂｐ，Ｄ种为６６３ｂｐ）的片段区分蚊种。结果：该法敏感性达１／１６００单蚊抽提ＤＮＡ或１／５单条蚊腿水匀浆ＤＮＡ。应用该法检测大劣按蚊ＡＦＲＩＭＳ实验室品系１０例，ＨＮ实验室品系２０例，以及采自海南省白沙、和平、罗葵、毛阳等地野外样本１４８例，均显示Ａ种特异带；云南省勐腊地区野外样本３０例，全部为Ｄ种特异带。结论：提供一种简便可靠的蚊种鉴别ＰＣＲ法，确认我国海南和云南的大劣按蚊分别为Ａ种和Ｄ种，为深入研究我国大劣按蚊复合体不同成员种的地理分布、生态习性和传疟作用创造了条件。

应用mtDNA-COⅠ基因序列研究我国大劣按蚊A、D群体的遗传差异

目的应用线粒体DNA细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(mtDNA-COⅠ)基因序列特征阐明我国大劣按蚊A、D群体的遗传差异和分化水平。方法研究样本包括大劣按蚊A海南群体(n=13),大劣按蚊D云南江城群体(n=17)和勐腊群体(n=17),所有样本均以rDNA-ITS2序列差异为依据,进行分子鉴别确认;扩增和测定mtDNA-COⅠ基因片段,用MEGA(Version2.1)、TCS(Version1.12)、ARLEQUIN(Version2.0)等软件对基因序列进行生物信息学分析。结果分析mtDNA-COⅠ基因中长度为959bp的片段,显示大劣按蚊A的单倍型共3个,大劣按蚊D的单倍型共6个,均匀分布于3个群体。勐腊群体内错配平均数(7.4412)明显大于江城群体(1.2794)和海南群体(1.0513),表明勐腊群体内个体间分化程度最大。分步AMOVA的计算结果显示群体间基因交流有限(Fst=0.7999),群体间变异(79.99%)明显大于群体内变异(20.01%)。结论我国大劣按蚊A、D群体之间的遗传差异较小,个体间的分化水平较高。

二氯苯醚菊酯浸泡蚊帐防制大劣按蚊及疟疾的现场研究

１９８９年４月～１９９２年３月在海南万宁县北大乡进行了二氯苯醚菊酯浸泡蚊帐防疟试验。在现场选择１０个自然村６１２６人为实验区。浸帐前一年进行了流行病学基本数据调查，１９９０年４～５月和１９９１年４月分别用二氯苯醚菊酯５００ｍｇａｉ／ｍ２剂量浸泡蚊帐，浸帐率９８．２％，两次药帐人口覆盖率分别为７３．６％和７３．５％。实验区浸帐前（１９８９年６～１２月）平均月发病率９．９６‰，浸帐后分别降为３．４５‰（１９９０）和２．０７‰（１９９１），比浸帐前同期分别下降６５．４％和７９．２％。其中恶性疟下降尤其迅速而明显。三年试验结果表明，二氯苯醚菊酯浸泡蚊帐对大劣按蚊自然种群密度及疟疾传播均有明显的防制效果。

用rDNA研究海南省大劣按蚊的种型分类地位

目的 :为了进一步确定海南省大劣按蚊的种型分类地位。方法 :以采自海南省的大劣按蚊实验室品系、野外现场捕蚊及采自泰国的大劣按蚊 A种 ( AFRIMS实验室品系 )为材料 ,用 PCR扩增比较海南省与泰国大劣按蚊的 r DNA第二内转录间隔区 ( ITS2 )序列。结果 :测出序列 84 1bp,包括 ITS2及两侧的 5.8S和 2 8S编码基因的一小部分序列 ,ITS2长 716bp,海南省与泰国大劣按蚊序列相同 ,未发现种内或种群内变异。结论 :证实海南省存在大劣按蚊 A种 ,与以往染色体核型分析及蚊卵扫描电镜的观察结果一致。

大劣按蚊含硫脂蛋白基因在约氏疟原虫感染中的作用

目的分析大劣按蚊含硫脂蛋白(TEP1)基因在约氏疟原虫感染过程中的作用。方法根据GenBank中大劣按蚊TEP1基因序列设计带有T7启动子的引物,以大劣按蚊cDNA为模板,进行PCR扩增,纯化产物,体外转录试剂盒合成AdTEP1双链RNA。羽化1～2日的雌性大劣按蚊分3组(200只/组):TEP1干扰组、绿色荧光蛋白(EGFP)干扰组和对照组。TEP1、EGFP干扰组按蚊分别进行胸部微量注射AdTEP1双链RNA、EGFP双链RNA各147 ng,对照组未处理。干扰后3d,每组取15只按蚊,去头,以大劣按蚊核糖蛋白S7(AdS7)为内参进行半定量PCR,检测干扰效果。干扰后4d,用约氏疟原虫BY256荧光株感染3组大劣按蚊。感染后9d,每组各解剖25只蚊胃,记录感染率和感染度。结果对照组和EGFP干扰组AdTEP1的表达条带亮度基本一致,而TEP1干扰组AdTEP1的表达条带亮度非常微弱。感染后9 d,蚊胃卵囊数统计学分析表明,对照组、EGFP干扰组和TEP1干扰组感染率分别为(24±2.83)%、(24±0.71)%和(80±3.54)%;感染度分别为0.32±0.7、0.44±0.85和5.52±4.84,TEP1干扰组明显高于对照组和EGFP干扰组(P<0.05)。结论 AdTEP1干扰后明显增加了大劣按蚊的感染率和感染度,增强了大劣按蚊对约氏疟原虫易感性。

大劣按蚊对约氏疟原虫卵囊黑化相关血细胞类型的初步鉴定

目的 鉴定与抗疟黑化反应相关的大劣按蚊血细胞。方法 采用姬氏染色法初步鉴定大劣按蚊血细胞类型 ,继而利用免疫细胞化学技术检测大劣按蚊血细胞内前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶。结果 颗粒细胞和浆细胞为大劣按蚊主要血细胞 ,前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶也主要分布于颗粒细胞和浆细胞内 ,其中颗粒细胞最常见。

感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白分析

目的获得并分析感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白。方法利用二维电泳方法分别分离感染约氏疟原虫前后的大劣按蚊血淋巴蛋白,进行考马斯亮蓝染色,并利用PDQuest 2D E lite软件分析和比较凝胶结果;对感染约氏疟原虫前后的差异表达蛋白进行质谱分析,获得肽质量指纹图谱;利用M ascot软件系统,在Sw iss-Prot等数据库中检索和分析所获得的肽质量指纹图谱。预测差异表达蛋白的生物学特性和在卵囊黑化中的功能。结果获得了分辨率和重复性均较好的二维电泳图,感染组凝胶可见120个蛋白点,正常组凝胶可见95个蛋白点,二者比较分析后发现有37个差异蛋白点;质谱分析获得3个肽质量指纹图谱,于蛋白数据库检索后未发现匹配分值很高的相关蛋白,其中差异蛋白点1与冈比亚按蚊一蛋白具有较高的同源性。结论获得了感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异蛋白和部分差异蛋白的相关信息,这为从蛋白水平认识蚊媒和疟原虫的相互关系和更深入地利用大劣按蚊-约氏疟原虫模型开展卵囊黑化的相关研究奠定了基础。

大劣按蚊AdPPO2、AdPPO3基因cDNA克隆与组织定位

目的 克隆大劣按蚊PPO基因家族新成员的cDNA部分序列 ,并对所克隆基因进行蚊体组织定位研究。方法 根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT PCR扩增、目的片段克隆入T载体 ,然后 ,用PCR方法筛选新的PPO克隆并测序 ;以RT PCR方法分析AdPPO2和AdPPO3在蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况。结果 AdPPO2和AdPPO3基因cDNA部分序列长均为 5 97bp ,编码 199个氨基酸 ;它们在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有分布。结论 从大劣按蚊成功克隆获得 2种新的PPO基因家族成员的cDNA部分序列 。

大劣按蚊丝氨酸蛋白酶cDNA克隆和表达

目的 克隆、表达大劣按蚊丝氨酸蛋白酶。方法 根据已报道昆虫的前酚氧化酶激活酶 (prophenoloxidase -acti vatingenzyme,PPAE)的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊血细胞mRNA为模板 ,进行RT -PCR扩增 ,克隆和测定插入片段 ;所得序列进行BLAST查询 ,并原核表达其中的两种PPAE样丝氨酸蛋白酶cDNA ,通过SDS -PAGE和Westernblotting检测表达产物。结果和结论 获得了 3种大劣按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列 ,即AdsP1(5 12bp) ,AdsP2(488bp)和AdsP3(5 12bp)。AdsP1和AdsP3与冈比亚按蚊sP14D1、sP14D2、3种昆虫PPAE和黑腹果蝇Easter很相似 ,推测AdsP1和AdsP3可能是大劣按蚊的PPAE ,起调节大劣按蚊黑化包裹约氏疟原虫反应的作用。另外 ,成功表达了AdsP1和Ad sP3部分cDNA序列。

大劣按蚊雄蚊的交配能力和日龄及交配次数对其生殖系统形态学影响的观察

本文在实验室条件下,观察大劣按蚊(Anopheles dirus)雄蚊交配能力和日龄、交配及交配后间歇期对其生殖系统形态学的影响。羽化后1小时可见丝状精子,22小时尾器全部旋转180°。3—12日龄雄蚊交配能力最强。随着日龄增加,精囊数逐渐减少,睾丸内成熟精子占据整个睾丸的比例逐渐增加,附腺透明区宽度变窄直至消失。多次交配比一次交配后,其睾丸内精子量减少、透明区宽度增加明显;交配后经过一定间歇期后,生殖系统能重新恢复活力,但多次交配后其恢复程度和速度远比交配一次者为慢。大劣按蚊雄蚊生殖系统的变化可初步判断其日龄和交配史。

大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建与质量鉴定

目的 构建大劣按蚊成蚊cDNA文库 ,为进一步筛选、克隆按蚊免疫及疟原虫发育相关基因奠定基础。方法 分离大劣按蚊成蚊mRNA ,用Stratagene公司的ZAPExpress文库构建试剂盒构建cDNA文库并鉴定其质量。结果 所建文库滴度达 2 1× 10 6pfu/ml,重组效率达 98%以上 ,插入片段长度平均为 1kb以上。

大劣按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的 探讨大劣按蚊差异表达蛋白与约氏疟原虫卵囊黑化的相互关系。方法 将雌大劣按蚊成蚊分为吸糖水组、正常小白鼠血组和约氏疟原虫感染血组 ,以挤压法收集各组的血淋巴 ,解剖中肠并利用超声波提取其蛋白 ,继而对血淋巴和中肠蛋白进行SDS PAGE分离 ,Westernblot检测丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶的表达差异 ,并利用免疫组织化学进行血细胞丝氨酸蛋白酶与前酚氧化酶的定位检测。结果 SDS PAGE显示吸糖水大劣按蚊有 3 4条蛋白带 ,而吸正常小鼠血和吸感染血蚊血淋巴有 3 5条蛋白带 ,而且在分子量约 160× 10 3和 66× 10 3的蛋白差异带显著 ,吸正常血及感染血后表达增强。吸糖水和吸正常小白鼠血组血淋巴丝氨酸蛋白酶呈现 2条带 ,分子量分别约 160× 10 3和 15 0× 10 3,3组蚊血淋巴前酚氧化酶呈现 1条带 ,分子量约 66× 10 3,吸正常小鼠血和吸感染血组蚊 1d后血淋巴丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶表达均显著上调 ,尤其疟原虫感染后表达最强。感染 1d后中肠前酚氧化酶带型明显增宽。免疫酶化学显示 ,丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶在血细胞内均呈颗粒状分布 ,血细胞外血淋巴液内有少许散在颗粒分布。结论 约氏疟原虫卵囊黑化期间 ,大劣按蚊血淋巴丝氨酸蛋白酶和前酚氧化酶表达增强 ,提示二者可能参与了卵囊黑化包裹?

大劣按蚊不同时期游离氨基酸的变化

大劣按蚊幼虫期有28种氨基酸,β-丙氨酸含量最高;蛹期有27种氨基酸,雄蛹氨基酸总量比雌蛹高,其中羟脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、酪氮酸、β-丙氨酸,精氨酸含量较高;雄蚊有28种、雌蚊有27种氨基酸,雄蚊氨基酸总量比雌蚊高,其中羟脯氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸含量较高。结果表明:同一种昆虫,不同时期、雌、雄的氨基酸含量和比例有差异。

约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO4基因转录与卵囊内Ca^(2+)的影响

目的 观察约氏疟原虫感染对大劣按蚊前酚氧化酶 (prophenoloxidase ,PPO)基因转录的影响与卵囊黑化期间囊内Ca2 + 的变化 ,探讨疟原虫感染不易感蚊种时卵囊黑化的相关机制。方法 分别在大劣按蚊吸血感染约氏疟原虫前与感染后 1、2、3和 5d抽提蚊总RNA进行RT PCR ,PCR扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后扫描进行凝胶图像分析 ,并对所得数据进行统计学处理。在吸血感染后 5、7、11和 15d解剖分离按蚊中肠 ,以荧光染料Fluo 3 Am作为卵囊内Ca2 + 指示剂 ,利用共聚焦扫描显微镜观察不同时期约氏疟原虫卵囊内Ca2 + 的分布及变化。结果 吸血感染约氏疟原虫前大劣按蚊PPO4基因的RT PCR扩增产物较少 ,但感染后明显增加 (P <0 0 1) ,尤其在感染后 1d与 2d最为明显 ;约氏疟原虫未黑化卵囊内Ca2 + 为( 13 7 15± 7 0 2 )nmol L ,完全黑化卵囊内Ca2 + 为 ( 18 44± 1 75 )nmol L、并在囊壁出现明显的钙沉着。结论 吸血感染约氏疟原虫后大劣按蚊PPO4基因转录比感染前明显增强 ,黑化卵囊内Ca2 + 较未黑化卵囊明显减少 。

大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库的构建

目的构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊免疫差异新基因奠定基础。方法以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后24h的大劣按蚊作为T组和D组,采用抑制差减杂交方法和T/A克隆技术构建大劣按蚊抗约氏疟原虫感染相关cDNA文库。结果扩增差减cDNA文库获得2500余个白色阳性克隆,随机挑取白色克隆进行PCR扩增,92%的克隆中均有200～600bp的插入片段,测序显示,有与冈比亚按蚊未知功能基因同源的克隆。结论成功构建了大劣按蚊差异基因文库。