家兔大型艾美尔球虫四川株的致病性和免疫原性研究

【目的】为调查兔大型艾美尔球虫四川株的致病性和免疫原性。【方法】本研究利用实验室分离到的大型艾美尔球虫四川株进行了动物感染试验。【结果】5×10~3和5×10~4个卵囊组的SPF兔在接种后第4~9天,出现轻微的食欲减少症状;5×10~5组在接种后第6~8天持续中度腹泻,第8天体重与对照组有明显差异(P≤0.05),但均无死亡现象。感染剂量为5×10~3时卵囊产量最多,为2.31×10~8;免疫原性实验中,7×10~5个卵囊攻毒后,5×10~3卵囊免疫组卵囊排出最少,为6.28×10~4,各组体重与对照组相比无明显差异。【结论】大型艾美尔球虫四川株致病性较弱,但免疫原性良好,可作为兔球虫疫苗的备选组分。

大型艾美耳球虫18S rDNA部分序列测定与系统发育分析

从河北某兔场分离大型艾美耳球虫卵囊,CTAB法提取基因组DNA。利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增大型艾美耳球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序。将测得的序列用DNAStar软件分析并与GenBank中公布的11种兔球虫的相应序列进行同源性比较,绘制系统进化树。结果表明,扩增出大小约为1522bp的18S rDNA片段,序列分析显示河北株大型艾美耳球虫18S rDNA与GenBank公布的大型艾美耳球虫18S rDNA比对,同源性达99.6%;与国外的11种兔球虫相应序列同源性在92.4%～99.6%之间。

不同地理株大型艾美耳球虫单卵囊分离及卵囊产量的比较

目的为组成1个遗传变异较大的大型艾美尔球虫株作为早熟选育的背景。方法从河北省无极县、河北省张家口市、浙江省舟山市、江苏省南京市、四川省乐山市、云南省昆明市6个不同地区的兔场采集兔粪,收集卵囊,培养至孢子化。根据大型艾美尔球虫的形态特征,采用改进的琼脂板法单卵囊分离技术将混合兔球虫种分离开,单卵囊接种无球虫兔,当有大量卵囊排出时分别收集不同地理株的卵囊,孵化后接种无球虫兔,1×10^4卵囊/只,在接种后6~16 d的排卵期间,每天収粪、计数,并记录每只兔的排卵量。结果单卵囊接种的成功率为88.9%;用1×10^4个卵囊接种无球虫兔后,不同地理株的卵囊产量,张家口株最多,依次为无极株、南京株、乐山株、昆明株,舟山株最少。结论单卵囊分离的成功率较高,不同地理株排卵量不同。

扫描电镜对兔大型艾美耳球虫致病性的研究

扫描电镜对兔大型艾美耳球虫致病性的研究史晓春，林昆华（北京农业大学兽医学院）大型艾美耳球虫（Ｅ．ｍａｓｎａ）是一种普遍寄生于兔肠道的球虫，能阻碍生长，造成严重的经济损失。该种自１９２５年Ｐｅｒａｒｏｌ报道以来，对其致病性的报道不一［１，２］。应用扫描...

大型艾美耳球虫生物学特性研究

为了掌握大型艾美耳球虫原始株的生物学特性,通过对大型艾美耳球虫原始株的潜隐期、致病性、免疫原性及药敏特性等方面进行研究。结果表明,大型艾美耳球虫原始株的潜隐期为168h,孢子化所需时间为37h^42h;在致病性试验中,不同接种剂量的显露期和排卵高峰一致,但卵囊产量不同,其中接种剂量为5×10~3个卵囊组的产卵囊量最多,与对照组相比,各感染组均出现不同程度的临床症状和病理变化。在免疫原性试验中,低剂量免疫(100个卵囊)可以对30 000个卵囊的攻虫量产生完全的保护力。在药敏试验中,根据临床表现、卵囊排出量、饲料转化率判断,大型艾美耳球虫对3种抗球虫药的药效最好是莫能菌素,药效最低的是氯苯胍。大型艾美耳球虫原始株致病性较强,免疫原性良好,对莫能菌素敏感,即莫能菌素对其有良好的防治效果,可作为防治家兔感染大型艾美耳球虫的首选药之一。

大型艾美耳球虫重组蛋白GAPDH对兔的免疫保护效果评价

本研究旨在评价大型艾美耳球虫重组蛋白(rEm-GAPDH)对兔的免疫保护效果,为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。根据转录组数据筛选出Em-GAPDH基因,进行原核表达与蛋白纯化;将50只45日龄无球虫感染幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEm-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白和1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1mL 100μg rEm-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫,二免14 d后每只兔经口感染1×10^(5)个大型艾美耳球虫孢子化卵囊,观察各组兔临床症状,每周固定时间采血和称重,感染14 d后宰杀剖检并测定和统计各组兔的卵囊排出量、相对增重、特异性IgG抗体和细胞因子等。结果成功表达了重组蛋白rEm-GAPDH,大小在59 ku左右,且大部分表达在包涵体。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现症状,而免疫组症状不明显。rEm-GAPDH免疫组的卵囊减少率达57.16%,相对增重率显著大于不免疫攻虫组(P<0.05),ACI值为144.96。特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与对照组存在显著差异(P<0.05)。大型艾美耳球虫重组蛋白rEm-GAPDH可以减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可以作为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。

兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫PCR检测靶标的筛选与单一、多重直接PCR检测方法的建立

旨在建立快速、简便的兔斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫直接PCR检测方法。首先克隆斯氏艾美耳球虫线粒体基因组mtDNA和3种兔球虫顶质体基因rpoB,结合GenBank中收录的其它兔球虫的相关序列进行比对分析,然后以种间差异明显的序列为靶基因在其超变区设计多对特异性引物,同时对引物浓度等条件进行优化,并评价PCR方法的敏感性和特异性。本研究首次测定了斯氏艾美耳球虫线粒体基因组全序列和3种兔球虫顶质体基因rpoB的序列,斯氏艾美耳球虫mtDNA全长6277 bp,包括3个蛋白质基因,与其它6种兔球虫mtDNA序列相似率为93.90%~97.45%;斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和大型艾美耳球虫顶质体基因rpoB大小在500 bp左右,三者相似性达93.93%~95.30%。靶基因筛选结果表明3种兔球虫ITS与其它基因(rpoB和mtDNA)相比较具有种内保守和种间差异大的特点,更适合用于分子诊断;基于3种兔球虫ITS序列的引物中,Ps1、Pi2、Pm2在单一或多重检测时均具有良好的特异性和敏感性。本试验通过对艾美耳球虫PCR检测候选基因靶标(ITS、mtDNA和rpoB)进行序列分析,筛选ITS为兔球虫种间差异明显的检测靶标基因,在此基础上建立的单一直接PCR方法和多重直接PCR方法具有特异、敏感、操作简便的优点,可用于3种兔球虫的流行病学调查或兔球虫病临床诊断。

3种兔艾美耳球虫rDNA ITS序列测定与系统进化分析

为研究内转间隔区(ITS)序列能否作为鉴别不同种兔球虫的分子标记,本试验以兔肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和大型艾美耳球虫为研究对象,对其核糖体DNA(rDNA)ITS全序列进行PCR扩增,扩增产物纯化后连接至pGEM-T Easy载体上,重组质粒通过菌液PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中公布的兔球虫ITS序列进行同源性比对,用Mega 5.0绘制系统进化树。结果显示,兔肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和大型艾美耳球虫ITS序列长度分别为1065、1009和1047bp,与GenBank公布的同种球虫相应序列同源性分别为99.2%、99.0%和94.5%,与其他种球虫序列的同源性为55.3%~82.1%。系统进化树显示兔球虫ITS序列形成单系群,该单系群又根据卵囊外残体的有无分为2个亚群。研究结果表明ITS序列种内同源性高于种间同源性,可作为3种兔球虫种间鉴定的分子标记。

兔肠道球虫病三重PCR方法的建立与应用

为建立一种能同时检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的三重PCR方法,试验首先根据GenBank中的兔穿孔艾美耳球虫Eper基因、黄艾美耳球虫Efla基因、大型艾美耳球虫Eman基因序列设计3对特异性引物,通过优化PCR反应的退火温度和引物浓度,建立一种用于检测兔肠道球虫病的三重PCR方法,然后对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评价,最后分别采用该方法及单一PCR方法对82份临床样本进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:所建立的三重PCR方法的最佳退火温度为59.7℃,最佳引物(F/R)浓度为0.15/0.15,0.20/0.20,0.20/0.20μmol/L(Eper、Efla、Eman基因);该方法能特异性扩增出兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊靶基因,而斯氏艾美耳球虫、大肠杆菌及沙门氏菌的检测结果为阴性;能够检测出穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊基因组DNA的最低限值分别为6.0,6.4,8.0 pg,两种模板浓度组合(60,64,80 ng/μL和6.0,6.4,8.0 ng/μL)批内重复性试验和批间重复性试验所有重复均扩增出预期目的条带;临床样本中,该方法的单一球虫检出率为53.6%,两种球虫检出率为30.5%,三种球虫检出率为7.3%;除黄艾美耳球虫+大型艾美耳球虫的混合感染类型两种方法检测结果的符合率为91.8%外,其他感染类型两种方法检测结果的符合率均为100%,整体符合率为98.8%。说明成功建立了一种可用于检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的多重PCR方法,该方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点。

西宁市某养兔场球虫病的调查

采用饱和盐水漂浮法和McMaster’s法对西宁市某养兔场球虫病的感染情况进行了调查。结果表明 :兔球虫病感染率和o .p .g值分别是 :3 0～ 40日龄 10 0 % ( 3 5份 3 5份 ) ,5 685 ( 12 0 0～ 1940 0 ) ;90～ 12 0日龄 86 7% ( 13份 15份 ) ,1760( 0～ 740 0 )。球虫种类共发现 6种 :穿孔艾美尔球虫 (Eimeriaperforans) ,大型艾美尔球虫 (E .magna) ,中型艾美尔球虫 (E .media) ,小型艾美尔球虫 (E .exigua) ,肠艾美尔球虫 (E .intestinalis)和斯氏艾美尔球虫 (E .stiedae)。

妥曲珠利及其复方制剂对人工感染大型艾美耳球虫病兔的治疗

大型艾美耳球虫(Eimeria magna)是引起球虫病的主要兔球虫种类之一,药物防治依然是目前兔球虫病的主要控制手段,然而,耐药虫株的出现影响了抗球虫药物的防治效果,针对不同地理虫株筛选有效的药物或复方制剂是提高药物临床应用效果的重要途径。本研究以兔大型艾美耳球虫为模型,通过人工感染无球虫兔,来评价妥曲珠利及其复方制剂治疗兔球虫病的效果。试验结果显示,妥曲珠利-莫能菌素复方制剂(TOL-MS)的治疗效果最佳,在感染后第14天,TOL-MS治疗组兔平均低质量与不感染不用药组相当,为(825.60±33.61)g,显著高于妥曲珠利(TOL)、妥曲珠利-磺胺喹恶啉(TOL-SQ)和感染不用药组;并且,在感染E.magna后,除TOL-MS治疗组和不感染不用药组兔无临床症状外,其他各组兔均出现了不同程度的食欲不振、便秘和拉稀症状;而且,与感染不用药对照组相比,TOL-MS治疗组的E.magna卵囊减排率最高,为(99.22±0.09)%,高于TOL治疗组的(96.79±0.59)%,显著高于TOL-SQ治疗组的(9.51±5.87)%。该研究筛选到1种治疗兔球虫病效果显著的妥曲珠利复方口服溶液剂,将为兔球虫病防治提供有效的手段和科学依据。

中药提取物对兔大型艾美耳球虫的预防效果观察

本试验以大型艾美耳球虫为攻虫虫种,研究中药提取物和氯羟吡啶对兔肠球虫的防治效果,开展抗球虫药物筛选。选择28日龄新西兰白兔162只随机分成中药1组、中药2组、中药3组、氯羟吡啶药物组、阳性对照组、阴性对照组。试验结果表明,各试验组之间的初重、末重、平均日增重差异不显著(P>0.05);但阴性对照组和中药3组死亡率显著低于其他各试验组(P<0.05),同时中药2组和氯羟吡啶药物组的死亡率显著低于中药1组与阳性对照组(P<0.05)。综上所述,抗球虫中药的添加量为1 kg/t日粮时,可有效防治大型艾美耳球虫感染。

大型艾美耳球虫早熟株的选育及18S rDNA系统发育分析

通过对6株田间大型艾美耳球虫早熟选育，经20次传代，潜在期由156h缩短至132h，连续5次无选择压力传代，其潜在期不变，说明所获得的大型艾美耳球虫早熟株遗传性状稳定；早熟株与原始株卵囊的结构有差异（早熟株每个孢子囊舍有1个大折光体而原始株每个孢子囊含有2个小折光体），大小差异不显著；同时对早熟株进行了系统发育分析，进化树显示：大型艾美耳球虫早熟株、原始株及GenBank中兔大型艾美耳球虫18S rDNA序列均聚为一个分支。

兔大型艾美耳球虫研究进展

大型艾美耳球虫是引起兔球虫病的主要球虫种类之一,具有明显的致病性和良好的免疫原性。自1925年由Perard首次报道以来,国内外学者对其进行了大量研究,取得了显著成果。本文回顾了大型艾美耳球虫形态、发育、致病性、免疫原性以及分子生物学等方面的相关研究进展,以期对该种球虫研究现状有较全面的认识。

实验用家兔体内寄生虫的调查

1987年11月我们对实验用兔进行粪检和尸体解剖共52只(雌31,雄21),其中大耳白兔42只,青紫蓝7只,黑兔3只,体重平均为2.21±0.7公斤。一、粪便检查 1.球虫感染:饱和盐水漂浮法阳性51例,阳性率98％。直接涂片法只检获37例。两种方法结果差别有显著性(X^2=14.48,P【0.01)。51例球虫感染中,穿孔艾美球虫(Eimeria perforans)、中型艾美球虫(E.media)、大型艾美球虫(E.magna)3种混合感染为30例,占球虫感染者的58.8％;两种肠球虫合并感染为17例(33.3％);只4例为单纯感染。 2.粪类圆线虫:粪检虫卵阳性16例。

3种兔球虫18S rDNA部分序列测定与系统发育分析

采用单卵囊分离法从河北某兔场分离大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫,接种无球虫兔后获得大量纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序。将3种球虫18S rDNA测序结果与GenBank中发布的兔球虫18S rDNA序列用DNAStar软件进行比对。使用MEGA4.0软件对兔球虫18S rDNA进行同源性比较,并绘制遗传进化树。结果表明,大型艾美耳球虫扩增出大小为1 521bp的18S rDNA片段;黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫均扩增出大小为1 520bp的18S rDNA片段。序列比对结果显示,3种河北株兔球虫与GenBank中相应的3种兔球虫18S rD-NA(EF694016、EF694011、EF694012)相似性分别为99.6%、99.6%和100%。3种河北株兔球虫序列和GenBank中兔球虫18S rDNA序列(EF694007-EF694017)位于一个单系集群。

3种兔球虫ITS-1序列测定与系统发育分析

从河北省兔场分别单卵囊分离孢子化大型艾美耳球虫卵囊、黄艾美耳球虫卵囊及肠艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔后获得纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18SrDNA和5.8SrDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫ITS-1片段,产物纯化后测序。将3种球虫ITS-1测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离比较,绘制系统发育树。结果表明,大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫河北株分别扩增出424、455、434bp的ITS-1片段。大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫河北株与GenBank中发布的同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为97.4%、97.9%和96.9%。系统发育树显示兔球虫ITS-1序列形成1个单系群,该单系群根据寄生部位分为2个姊妹群。