高效液相色谱-质谱技术在蛋白质组学中的应用

蛋白质组学研究在生物医学领域发挥了重要作用,然而研究面临的主要难点在于其研究对象的复杂性和多样性。随着质谱技术的快速发展,高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分离分析复杂生物样品已经成为蛋白质组学研究的基础工具。蛋白质组学的研究从肽段分离,延伸到蛋白质和蛋白质复合物的分离,随着分析物的分子质量不断增大,其结构和组成复杂性也持续增加,分子特性也发生改变。面对不同的蛋白质组学研究对象,选择不同的分离模式、分离条件以及固定相参数是进行深度蛋白质组学研究的关键。本文综述了实验室常用的液相色谱分离模式,包括反相色谱(RPLC)、亲水相互作用色谱(HILIC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱(IEC)和体积排阻色谱(SEC),以及其不同的组合模式与质谱联用在自下而上(bottom-up)分析、自上而下(top-down)分析、蛋白-蛋白相互作用分析中应用的研究。具体分析了色谱流动相与被分析对象之间的兼容性问题、色谱流动相与质谱兼容性问题,以及多维色谱中不同色谱模式之间流动相的兼容性问题。重点关注存在不兼容问题时研究者所提出的解决方案。此外,本文还评述了HPLC-MS结合样本前处理的方法在外泌体和单细胞蛋白质组学中的应用研究。总之,文章聚焦于近年来HPLC-MS技术在蛋白质组学中的研究进展,旨在为未来蛋白质组学领域的研究提供参考。

体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱测定印度芥菜中镉的形态

建立了体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(SEC-HPLC-ICP-MS)测定镉超积累植物印度芥菜中镉的形态分析方法。在镉胁迫下,诱导产生植物螯合肽(PCs)。因此,在叶片和根部均检测到植物螯合肽(PC)3-Cd、植物螯合肽(PC)2-Cd、谷胱甘肽(GSH)-Cd,及半胱胺酸(Cys)-Cd4种形态。研究结果证明,植物螯合肽的合成机制为先形成GSH-Cd而后形成植物螯合肽。在植物不同部位,Cd存在形态不同。叶片中主要以GSH-Cd存在,而在根部主要以PC2-Cd为主,结合不同镉刺激浓度条件下植物体内镉分布规律初步推断:根部PC2-Cd除了自身合成产生外,还有部分为叶部转移。为了防止巯基化合物氧化反应的发生,样品采取液氮保护并于-70℃保存,样品分析全流程用氮吹防氧化措施。

体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定海产贝类中镉的形态

运用体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术(SEC-HPLC-ICP-MS)分析了高镉积累扇贝和低镉积累菲律宾蛤仔中镉的存在形态,并结合体外全仿生消化技术,研究了在唾液、胃、肠无机物和有机物(含消化酶)作用下,扇贝和菲律宾蛤仔中镉的主要存在形态。结果发现:扇贝中Cd总量约为菲律宾蛤仔的10倍;在扇贝中检测到3种Cd形态:金属硫蛋白(MT)-Cd、谷胱甘肽(GSH)-Cd和半胱氨酸(Cys)-Cd;在菲律宾蛤仔中检测到2种Cd形态:MT-Cd和GSH-Cd;以峰面积作参考进行比较,扇贝中MT-Cd和GSH-Cd含量分别约为菲律宾蛤仔的5.6和2.0倍。结合体外全仿生模型发现,在扇贝胃全仿生提取液中,检测到1种未知小分子有机镉形态(Cd-X),在扇贝肠全仿生提取液中检测到4种Cd形态,其中MT-Cd是主要形态;而在菲律宾蛤仔胃、肠全仿生提取液中均仅检测到1种未知小分子有机态镉(Cd-X)。本实验证明贝类中的MT-Cd,GSH-Cd,Cys-Cd中络合的Cd在生物体胃肠消化液作用下会发生解离。

体积排阻高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱法测定紫菜中镉(Cd)的形态

运用体积排阻高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱联用技术(SEC-HPLC-ICP-MS)分析了紫菜中Cd的存在形态,结果发现,在紫菜水提取液中检测到3种Cd形态,根据其保留时间确定为植物螯合肽(PC)3-Cd、谷胱甘肽(GSH)-Cd和1种未知小分子有机态Cd,结合体外全仿生消化技术,研究了在唾液、胃、肠无机物和有机物(含消化酶)作用下,紫菜中Cd的主要存在形态,分析发现在紫菜胃全仿生提取液中,检测到2种未知小分子有机态Cd,其中以保留时间为24.2 min的Cd形态为主要存在形态。在肠全仿生提取液中检测到2种Cd形态,其中(PC)3-Cd是主要存在形态。有关(PC)3-Cd在生物体内的代谢规律还需进一步研究。实验确证了Cd在紫菜中的主要有机形态,为紫菜食用安全风险评价提供重要依据。

体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时测定印度芥菜(Brassica Juncea)中镉铜锌形态

建立了体积排阻高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法同时测定印度芥菜中镉、铜、锌形态分析方法。为了防止巯基化合物氧化反应的发生,样品采取液氮保护并在-70℃保存,样品分析全流程采取氮吹防氧化措施。在镉、铜、锌胁迫下,诱导产生植物螯合肽(PCs)。在叶片和根部均检测到3种元素的4种形态,植物螯合肽(PC)3-Cd(Cu,Zn)、植物螯合肽(PC)2-Cd(Cu,Zn)、谷胱甘肽(GSH)-Cd(Cu,Zn)、半胱胺酸(Cys)-Cd(Cu,Zn)及其在植物体内的分布规律。结合植物不同部位Cd、Cu、Zn分布规律初步推断,Cd、Cu、Zn在与GSH及Cys的结合上存在竞争。

高效排阻液相色谱法分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度

本文采用SE-HPLC法定量分析大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度。首先,对SE-HPLC的色谱条件进行优化,最佳的SE-HPLC色谱条件是:洗脱液(水/乙腈)70/30,洗脱液流速1.0 m L/min,进样量10μL。其次,绘制分子质量分析的标准曲线,分子质量标准曲线方程为Log(M)=-0.222 1 x+3.878 9,线性相关系数为R^2=0.996 9。以10倍信噪比确定定量限,得到7S(y=299.59x+3.771 2,R^2=0.979 2)和11S(y=197.08x+4.148 5,R^2=0.986 1)纯度分析标准曲线方程。最后根据分子质量和纯度分析的标准曲线方程计算大豆7S和11S球蛋白的分子质量和纯度。将所提纯的7S和11S样品的分子质量与7S和11S标品特征峰分子质量进行比对,表明所提纯样品为7S和11S。本试验所制得7S和11S的纯度分别达到86.3%和92.0%。

体积排阻液相色谱法质粒的含量测定

首次以体积排阻液相色谱法进行质粒提取液浓度的测定研究,通过纯质粒溶液在260nm处的紫外吸峰面积与质粒浓度之间数据的线性最小二乘拟合,得到了反映质粒浓度和紫外吸收峰峰面积之间关系的标准曲线:Y=2×10-5X,通过验证实验,确定了质粒提取液中不同组分,如核糖核酸,蛋白质等在色谱图中的出峰位置。结合标准曲线测定了自制的质粒提取液的质粒浓度为0.32mg/mL。该方法方便,快捷,准确。

高效液相分子排阻色谱法分析重组人复合α干扰素稳定性

采用高效液相分子排阻色谱法(HPLC-SEC)分析不同温度、振荡时间和pH条件下缓冲液中重组人复合α干扰素(cIFN)单体降解和聚合程度,以研究cIFN的体外稳定性。分析表明,振荡会引起cIFN同时发生严重的降解和聚合,在振荡15 min后,聚合体质量分数23.8%,降解产物质量分数29.6%。温度和pH会引发严重降解和部分聚合,40°C下放置66 h会产生质量分数16.3%的聚合体和质量分数49.3%的降解产物;在pH 9放置66 h后会产生质量分数11.5%聚合体和质量分数37.7%的降解产物。研究显示HPLC-SEC方法能对不同环境条件下cIFN单体所发生的聚合和降解变化进行精确定量分析。不同环境下cIFN单体容易产生聚合体和降解产物表明:cIFN稳定性较差,蛋白质单体之间作用形式容易受到环境因素影响而发生改变。

高效液相体积排阻色谱法测定稻米支链淀粉链长的相对分子质量分布

【目的】建立稻米支链淀粉链长相对分子质量分布的高效液相体积排阻色谱法(high performance sizeexclusion chromatography,HPSEC)的测定方法。【方法】先采用丁醇沉降法分离提纯稻米支链淀粉,纯化后的支链淀粉经异淀粉酶酶解切开分支糖苷键,然后运用HPSEC测定其相对分子质量分布。建立了稻米支链淀粉链长相对分子质量分布的HPSEC分析方法:Shodex SB-G、Shodex SB-803(1 000—100 000)、Shodex SB-802.5(300—10 000)3根凝胶色谱柱串连,柱温40℃;流动相为0.1 mol.L-1Tris+0.1 mol.L-1NaCl,pH=7.40,流速0.5 mL.min-1;采用示差折光检测器(Differential refractive index detector,RI),检测器温度为37℃;待测样品浓度为5mg.mL-1,进样量20μL。【结果】本法提纯的稻米支链淀粉:淀粉含量为99.4%、蛋白残余为0.02%、支链淀粉碘复合物最大吸收峰为517 nm,为高纯度支链淀粉。供试大米样品脱分支支链淀粉的平均聚合度(DP)分布在2—120,无杂峰干扰。【结论】试验结果和方法验证表明本方法数据可靠、重复性好、简单易行。

聚合物共混物的超高效液相色谱-空间排阻色谱在线联用分离与表征

黏合剂和涂料行业中,聚合物共混物表征是分析的难题,分离技术的研究一直备受关注.本文设计并搭建了超高效液相色谱-空间排阻色谱在线联用系统(UHPLC-SEC),采用羟基聚丁二烯(HTPB)考察了二维色谱系统的溶剂兼容性及正交性,以苯乙烯-丁二烯嵌段共聚物(SBS)、苯乙烯-异戊二烯嵌段共聚物(SIS)和聚甲基丙烯酸酯(PMMA)共混物研究了二维色谱系统的适用性.结果表明,HTPB分子量及分布的UHPLC-SEC测定结果与SEC测定结果一致,峰尖分子量(M_(p))为3407 Da,重均分子量(M_(w))为6573 Da,分散系数(PDI)为2.36,相对标准偏差(RSD)均小于5.7%,系统的溶剂兼容性和正交性良好.UHPLC-SEC法测得聚合物共混物中PMMA,SBS和SIS的M_(p),M_(w)和PDI与单个聚合物的SEC测定结果的相对误差均小于7.1%.PMMA,SBS和SIS共混物在200℃加热3 h后,PMMA稳定不变,SBS和SIS组分明显降解.UHPLC-SEC在线联用方法对聚合物共混物的表征结果准确、重复性好,为聚合物配方产品的失效分析提供了一种重要且有效的手段.

高效液相体积排阻色谱法测定苦木注射液中大分子物质

目的:建立苦木注射液中大分子物质的高效液相体积排阻色谱(HPSEC)检测方法。方法:色谱柱为TSK G2000SWxl凝胶柱(300 mm×7. 8 mm,5μm);以乙腈-0. 08%三氟乙酸水溶液(30∶70)为流动相;体积流量为0. 6 ml·min^(-1);检测波长为214 nm;柱温为30℃;按面积归一化法计算大分子物质的质量分数。结果:相对分子质量在1 638～13 700的物质,其相对分子质量对数-保留时间呈现良好的线性关系(r=0. 998 7);生长抑素、胸腺肽α1、人胰岛素、核糖核酸酶A的平均回收率分别为98. 9%,99. 4%,96. 6%,101. 2%,RSD分别为2. 5%,4. 4%,2. 7%,0. 6%(n=6); 20批苦木注射液均未检出大分子物质。结论:本方法简便易行,结果准确可靠,可作为苦木注射液质量控制方法。

体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成

建立体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-HPLC-ICP-MS)联用技术分析富硒大米含硒蛋白组成方法。通过水提、盐提、碱提和醇提方法提取,并用丙酮沉淀蛋白,硒的回收率分别为9.6%,16.8%,48.2%和14.9%,纯化后的蛋白结合硒的量由大到小依次为碱溶谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白>清蛋白。蛋白液经SEC-HPLC-ICP-MS检测,通过蛋白色谱峰(λ=280 nm)和ICP-MS硒峰(78Se)对比分析,利用分子量标准曲线测定出4类蛋白中含硒蛋白的分子量。结果表明,富硒大米中清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白。硒主要存在于>7 kDa的碱溶谷蛋白和球蛋白,其中碱溶含硒蛋白主要组分F1分子量为199.8 kDa。

过敏物的高效液相排阻色谱测定

采用高效液相排阻色谱对几种过敏物质,树木花粉、寄生虫和猫狗毛萃取物进行分析,测定主要成分的分子量。结果表明,高效液相排阻色谱适合过敏物质的成分分离和分子量测定。

高效凝胶排阻色谱法测定大豆多肽相对分子质量分布及不确定度评估

采用高效凝胶排阻色谱法测定大豆多肽保健品的肽相对分子质量分布。通过优化标准物质的选择和流动相组成比例等测定条件，考察方法的日内和日间精密度。以相对分子质量标准物质制作标准曲线，对大豆多肽中100～1000分子量范围的多肽分布进行了测定，测定结果的扩展不确定度为9.2，测量结果可表示为（63．3±9．2）％。

安捷伦科技推出具有先进蛋白质大小测量功能的液相色谱解决方案

2014年3月14日，北京——安捷伦科技公司（纽约证交所：A）宣布推出1260Infinity多检测器Bi0_SEC解决方案，该解决方案是整个Infinity液相色谱系统系列中的最新创新成果。新一代体积排阻色谱（SEC）系统具有先进的光散射检测功能、完全生物惰性的仪器、高分离度的色谱柱以及直观的软件。这些特性将素有“蛋白质聚集体分析的黄金标准”之称的SEC的分析速度、灵敏度以及重现性推向了全新的水平。

安捷伦科技推出具有先进蛋白质大小测量功能的液相色谱解决方案

安捷伦科技公司2014年3月14日在北京宣布推出1260Infinity多检测器Bio—SEC解决方案，该解决方案是整个Infinity液相色谱系统系列中的最新创新成果。新一代体积排阻色谱（SEC）系统具有先进的光散射检测功能、完全生物惰性的仪器、高分离度的色谱柱以及直观的软件。这些特性将素有“蛋白质聚集体分析的黄金标准”之称的SEC的分析速度、

冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱主峰右侧峰2蛋白鉴定

目的对冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)体积分子排阻-高效液相色谱(size exclusion chromatograghy-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)主峰右侧峰2蛋白进行鉴定,以明确该峰的蛋白成分,保证疫苗质量。方法将冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)进行SEC-HPLC分析,收集主峰右侧峰2,经超滤浓缩后,进行二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)还原、碘代乙酰胺(iodoacetamide,IAM)烷基化和胰蛋白酶(Trypsin)酶解,产物进行nanoLC-MS/MS串联质谱分析。结果冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2成功鉴定4个蛋白,单个蛋白匹配肽段数在59~79个之间;单个蛋白匹配特征肽段种数在6~12种之间;单个蛋白匹配特征肽段检出次数在20~36次之间;鉴定蛋白的序列覆盖率在37.40%~64.31%之间。参与统计的肽段共280个,质谱偏差均小于0.15 Da。结论冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液(无人白)SEC-HPLC主峰右侧峰2均来源于狂犬病病毒株4aGV,为疫苗颗粒解离物。

安捷伦科技推出具有先进蛋白质大小测量功能的液相色谱解决方案

2014年3月14日，北京安捷伦科技公司宣布推出1260 Infinity多检测器Bio-SEC解决方案，该解决方案是整个Infinity液相色谱系统系列中的最新创新成果。新一代体积排阻色谱（SEC）系统具有先进的光散射检测功能、完全生物惰性的仪器、高分离度的色谱柱以及直观的软件。

金属硫蛋白异构体及亚型异构体的液相色谱分离与质谱鉴别

建立了金属硫蛋白(MT)异构体及亚型异构体的色谱分离与质谱鉴别方法。将金属硫蛋白混合物通过弱阴离子DEAESephadexA 25离子交换柱,结合离线电感耦合等离子体质谱(ICP MS)对锌诱导金属硫蛋白的两个异构体MT 1和MT 2进行分离和检测;利用SephadexG 25凝胶排阻色谱柱对得到的两个金属硫蛋白异构体进行脱盐;探索脱盐后的金属硫蛋白异构体在不同色谱条件下的C18反相色谱柱上的保留行为,进而实现各个亚型异构体的分离;通过在线电喷雾质谱检测实现了对金属硫蛋白各个亚型异构体的鉴别。结果表明,通过优化色谱条件,由离子交换色谱及凝胶排阻色谱得到的金属硫蛋白各亚型异构体在酸性条件下均得到了良好的分离,质谱检测结果与前人的文献报道结果一致。该方法可使金属硫蛋白各异构体均达到最佳的分离效果。

四氢糠醇对α-胰凝乳蛋白酶在液相色谱中复性效率的影响

用高效疏水相互作用色谱 (HPHIC)研究了将四氢糠醇加入盐酸胍 (GuHCl)变性剂中或将四氢糠醇键合至硅胶基质时 ,对α 胰凝乳蛋白酶 (α Chy)复性效率的影响情况 ,并以α Chy的生物活性回收率对结果进行了表征。用尺寸排阻色谱 (SEC)与HPHIC的实验结果进行了比较 ,结果表明 ,四氢糠醇在变性剂中和键合至硅胶上时 ,均可提高α Chy的复性效率 ,但提高的程度不同。四氢糠醇在溶液中或在HPHIC固定相表面时具有辅助α Chy进行复性作用的机理可能是由于四氢糠醇与α Chy形成了复合物的形式。