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快捷的定点突变效率近100%的大引物PCR方法(英文) 被引量:8
1
作者 谢振华 史小军 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1490-1494,共5页
报道了一种新的PCR突变方法,它不需要纯化大引物或设计特别的旁侧引物.利用一个诱变引物和两个测序引物(Tm≤58℃)作为旁侧引物.第一轮PCR产物12.5μl直接加入到50μl的第二轮PCR反应体系作为模板和大引物,在开始第二轮PCR反应时,增加... 报道了一种新的PCR突变方法,它不需要纯化大引物或设计特别的旁侧引物.利用一个诱变引物和两个测序引物(Tm≤58℃)作为旁侧引物.第一轮PCR产物12.5μl直接加入到50μl的第二轮PCR反应体系作为模板和大引物,在开始第二轮PCR反应时,增加在68℃退火温度下进行10个循环的不对称PCR,这一步骤大大提高了通过600bp或800bp大引物所导致的突变效率.结果表明,该方法的产物能够达到高保真、97%~98%的突变效率和高产率. 展开更多
关键词 聚合酶链反应 定点突变 大引物
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大引物PCR定点突变方法的改进 被引量:5
2
作者 张碧乾 邓会群 +4 位作者 宫彩霞 杨青 彭建新 洪华珠 李爱英 《湖北大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2009年第1期79-81,共3页
对大引物PCR定点突变方法进行改进,主要包括:避免在一个PCR反应中同时使用扩增全长基因的常规引物,选择不同载体克隆原始基因和突变基因,通过抗性选择筛选突变子,从而完全避免原始基因的干扰.实验结果证明利用改进后的方法进行基因点突... 对大引物PCR定点突变方法进行改进,主要包括:避免在一个PCR反应中同时使用扩增全长基因的常规引物,选择不同载体克隆原始基因和突变基因,通过抗性选择筛选突变子,从而完全避免原始基因的干扰.实验结果证明利用改进后的方法进行基因点突变,可以减少操作步骤,提高突变频率. 展开更多
关键词 改进的大引物PCR点突变 基因克隆
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用滚环扩增与大引物PCR法高效构建定点突变序列 被引量:7
3
作者 赵松子 沈向群 《江西农业学报》 CAS 2009年第8期7-8,11,共3页
建立了一种简单、快捷的高效定点诱变方法。第一轮PCR反应中,上游引物和突变引物先以1∶10的比例进行不对称PCR,提高大引物突变比例。第二轮PCR反应以滚环扩增产生的单链DNA作为大引物PCR反应的模板,不需要优化PCR反应的条件,通过一般... 建立了一种简单、快捷的高效定点诱变方法。第一轮PCR反应中,上游引物和突变引物先以1∶10的比例进行不对称PCR,提高大引物突变比例。第二轮PCR反应以滚环扩增产生的单链DNA作为大引物PCR反应的模板,不需要优化PCR反应的条件,通过一般的反应条件就可得到大量PCR产物,并且诱变的成功率可达100%。 展开更多
关键词 滚环扩增 定点突变 PCR 大引物
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大引物PCR定点诱变技术的研究进展 被引量:1
4
作者 莫秋华 杨翠兰 徐湘民 《国外医学(遗传学分册)》 2003年第2期57-60,共4页
PCR技术自问世以来发展迅速 ,现已成为细胞生物学及分子生物学研究中常用的方法。而基于 PCR的定点诱变技术又成为研究基因的生物学特性 ,探索蛋白质结构和功能相关关系的强有力工具。其中的大引物 PCR定点诱变技术因其简便高效而倍受... PCR技术自问世以来发展迅速 ,现已成为细胞生物学及分子生物学研究中常用的方法。而基于 PCR的定点诱变技术又成为研究基因的生物学特性 ,探索蛋白质结构和功能相关关系的强有力工具。其中的大引物 PCR定点诱变技术因其简便高效而倍受研究者欢迎。本文从该技术的每一层面入手 。 展开更多
关键词 大引物 PCR 定点诱变技术 研究进展 细胞生物学 分子生物学 聚合酶键式反应
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一种改进的大引物PCR定点诱变方法 被引量:12
5
作者 莫秋华 徐湘民 +1 位作者 钟雄霖 刘忠英 《中华医学遗传学杂志》 EI CAS CSCD 2002年第1期68-71,共4页
目的 建立一种改进的、简便易行的大引物 PCR定点诱变技术。方法 在两轮 PCR中设计了两种不同的质粒 DNA模板 ,两者分别缺少正向或反向外侧引物可结合的互补序列 ;当两种模板和两条外侧引物同时存在于一个反应管时 ,可以完全避免对野... 目的 建立一种改进的、简便易行的大引物 PCR定点诱变技术。方法 在两轮 PCR中设计了两种不同的质粒 DNA模板 ,两者分别缺少正向或反向外侧引物可结合的互补序列 ;当两种模板和两条外侧引物同时存在于一个反应管时 ,可以完全避免对野生型目的基因全长的扩增。第 1轮 PCR由正向外侧引物和突变引物合成大引物 ,这一产物无需凝胶纯化而直接用于第 2轮 PCR。第 2轮 PCR的第 1阶段由大引物延伸合成全长突变终产物 ,两条外侧引物则在第 2阶段指数扩增 ,所有终产物均含所需致突变位点。结果 用此方法对中国人 β地中海贫血 15种稀少突变类型进行定点诱变 ,并将诱变得到的全长人 β珠蛋白基因克隆到 p GEM○R- T载体后全长测序 ,所有克隆均鉴定为所需突变型。结论 这种改进的大引物PCR定点诱变技术省时、省工 ,诱变的成功率可达 10 0 % ,适于实验室常规应用。 展开更多
关键词 大引物 聚合酶链反应 定点诱变 β珠蛋白基因
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邻近多位点基因突变的组合大引物PCR策略(英文) 被引量:2
6
作者 赵广荣 梁玲玲 +1 位作者 刘春杰 祝琳琪 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期59-62,共4页
报道了一种新的组合多位点突变策略,通过单管中三阶段聚合酶链式反应(PCR)得以实现。在第一阶段,PCR扩增出多位点突变大引物,然后在第二阶段延伸大引物,在第三阶段获得全长突变基因序列。基于退火温度与热循环参数的组合大引物反应的优... 报道了一种新的组合多位点突变策略,通过单管中三阶段聚合酶链式反应(PCR)得以实现。在第一阶段,PCR扩增出多位点突变大引物,然后在第二阶段延伸大引物,在第三阶段获得全长突变基因序列。基于退火温度与热循环参数的组合大引物反应的优化,三个阶段中退火温度差异小(低于10°C),成功扩增出多位点突变基因序列和比邻突变序列。是一种简单、高效的多位点突变方法。 展开更多
关键词 多位点突变 大引物PCR基因工程 组合三阶段PCR反应 人干扰素α
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在单个PCR管内快捷完成定点突变 被引量:6
7
作者 谢振华 史小军 蔡国平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期681-684,共4页
采用大引物方法,利用质粒多克隆位点两侧的普通测序引物作为旁侧引物,在单个PCR管内,经2个步骤共34个循环进行定点突变.该方法通过优化模板和引物的量达到降低PCR循环次数,通过加入10个在68℃复性条件下的PCR循环达到增加突变效率而无... 采用大引物方法,利用质粒多克隆位点两侧的普通测序引物作为旁侧引物,在单个PCR管内,经2个步骤共34个循环进行定点突变.该方法通过优化模板和引物的量达到降低PCR循环次数,通过加入10个在68℃复性条件下的PCR循环达到增加突变效率而无需胶纯化.本方法达到平均62%的突变效率,而且全长扩增产物的产率很高. 展开更多
关键词 定点突变 PCR 大引物
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Darier病ATP2A2基因A68E突变的定点诱变及其突变载体构建
8
作者 史丙俊 江阳 +3 位作者 薛梅 刁庆春 胡刚 冯捷 《中国皮肤性病学杂志》 CAS 北大核心 2013年第1期29-32,共4页
目的利用大引物PCR技术对发现的中国人Darier病ATP2A2基因A68E突变进行体外定点诱变,并构建携带有突变基因的真核表达载体。方法首先设计三条引物(包括两条外侧正向和反向引物以及内部突变引物),通过2轮PCR扩增,扩增出含有所需突变位点... 目的利用大引物PCR技术对发现的中国人Darier病ATP2A2基因A68E突变进行体外定点诱变,并构建携带有突变基因的真核表达载体。方法首先设计三条引物(包括两条外侧正向和反向引物以及内部突变引物),通过2轮PCR扩增,扩增出含有所需突变位点的片段(ATP2A2-A68E),然后将突变片段克隆入pGEM-T载体中,通过双酶切后进行连接,将目的片段重组至真核表达载体pcDNA3.1中。结果用大引物PCR法成功构建ATP2A2基因A68E突变片段,测序结果显示了ATP2A2基因上203位碱基C已变为A,此突变导致ATP2A2基因第68位密码子由丙氨酸变为谷氨酸。结论 pcDNA3.1-ATP2A2-A68E突变体的成功构建,为进一步进行该突变体的结构与功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 大引物PCR ATP2A2 毛囊角化病 定点诱变 PCDNA3 1
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以PCR为基础的定点诱变方法研究进展 被引量:3
9
作者 黃春晓 段学军 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2006年第12期5-8,共4页
以PCR为基础的定点诱变技术是近年来得到极大发展的分子生物学方法,不仅用于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究,还用于定点改造目的基因。综述了以PCR为基础的定点诱变的各种方法,并介绍了国内外最新的研究进展,重点介绍并分析了单管... 以PCR为基础的定点诱变技术是近年来得到极大发展的分子生物学方法,不仅用于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究,还用于定点改造目的基因。综述了以PCR为基础的定点诱变的各种方法,并介绍了国内外最新的研究进展,重点介绍并分析了单管大引物法、一步重叠延伸PCR、多位点环状诱变PCR及TAMS定点诱变等新方法,比较了不同方法的优缺点,分析了存在的问题并提出解决对策。 展开更多
关键词 PCR 定点诱变 重叠延伸法 大引物 多位点环状诱变 TAMS技术
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To Train or to Entertain the Brain: How Does Enhanced Focus of Attention Guide Perception into the Goal Directed Action
10
作者 Rado Gorjup Niko Gorjup 《Journal of Philosophy Study》 2017年第8期420-425,共6页
Different areas of cognitive science traditionally perceived the mind as an abstract information processing entity, whose interactions with the outside world should be of small or no relevance at all. However, a recen... Different areas of cognitive science traditionally perceived the mind as an abstract information processing entity, whose interactions with the outside world should be of small or no relevance at all. However, a recent embodied cognition perspective, view cognitive processes as deeply embedded into the body's interactions with the world. In support of such contention, lots of empirical evidence has been brought and thusly different claims proposed. In this paper, we present the computer based neurocognitive task of sustained attention which is a dual task with many characteristics that obviously mirror some of the above claims. In this regard, we take into consideration both on-line and off-line aspects of the embodied cognition and point out how processing efficiency and attentional functioning are crucial vehicles in bringing perception into effective action (embodied cognition). Furthermore, there is plenty of evidence about the bidirectional relationship between the attentional/cognitive functioning and emotion regulation as well. This rises new possibilities in looking at the cognitive bias modification approaches and brain-cognitive training procedures for human beings without perceiving them as disembodied minds or complex machines but instead proactive and physically involved in the real world. We argue that such cognitive training approaches even though at first glance seemed as mere technical and machine oriented procedures, should be regarded as humanistic in its nature which perfectly mirror the Merleau-Ponty's concept of "embodied subjectivity." Finally, we explain how such approaches can be successfully combined with the neurobiological accounts and effectively implemented into clinical practice (self-regulation, self-directed neuroplasticity, effortful control, behavior change). 展开更多
关键词 embodied subjectivity SELF-REGULATION effortful control attentional networks brain-cognitive training self-directed neuroplasticity
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A Survey on the Methods of Primer Design Among Plant Pathologists in Australia and New Zealand
11
作者 Francisco M. Ochoa Corona1 Brendan Rodoni Joe Tang 《Journal of Life Sciences》 2012年第5期476-480,共5页
Designing primers for PCR-based diagnostics was achieved by executing sight searches on DNA sequences. Visual searching for specific DNA targets is time consuming, subjective and requires optimisation among numerous c... Designing primers for PCR-based diagnostics was achieved by executing sight searches on DNA sequences. Visual searching for specific DNA targets is time consuming, subjective and requires optimisation among numerous candidate primer sets. Several primer design software have been linked to useful bioinformatic packages to speed the development of PCR assays. Despite the software options available, primer design has remained a challenging aspect of incursion responses, biosecurity emergencies and microbial forensic applications. Two surveys were conducted among 45 plant virologists and 21 other plant pathologists during the 7th Australasian Plant Virology Workshop and the 16th Biennial Australasian Plant Pathology Conference in 2006 and 2007, respectively. Results show that most primer design learning occurs scientist to scientist rather than during academic teaching. This tendency matches with 16% of scientists users of PCR, who do not engage in primer design and 25% designing primers only by visual means, combining a pool of 41% who if trained, would likely enhance their performance in primer design. Only 13 out of 58 scientists ranked themselves as experts. Implementing primer design in study programs and regional training will benefit plant pathology and entomology, and the responsiveness and performance of biosecurity and microbial forensics in the South Pacific. 展开更多
关键词 Primer design PCR education training BIOSECURITY microbial forensics plant pathology.
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抗凝血酶基因C2759T(Leu99Phe)突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究 被引量:9
12
作者 傅启华 王文斌 +7 位作者 丁秋兰 周荣富 武文漫 胡翊群 王学锋 严力行 王振义 王鸿利 《中华血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期148-151,共4页
目的 研究抗凝血酶 (AT)基因C2759T(Leu99Phe)突变引起AT缺陷症的分子机制。方法 用大引物法构建C2759T突变体AT重组表达质粒 (ATM2759 ),并将其和正常AT重组质粒(ATN)分别用Superfect试剂转染COS7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验和... 目的 研究抗凝血酶 (AT)基因C2759T(Leu99Phe)突变引起AT缺陷症的分子机制。方法 用大引物法构建C2759T突变体AT重组表达质粒 (ATM2759 ),并将其和正常AT重组质粒(ATN)分别用Superfect试剂转染COS7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验和细胞免疫荧光染色。结果 转染ATM2759的COS7细胞,培养上清液和细胞裂解液中的AT抗原 (AT∶Ag)分别为ATN的35. 63%和 174. 97%,而培养上清液中的AT活性 (AT∶A)为ATN的 47. 73%。细胞免疫荧光试验证实,转染ATM2759的CHO细胞,其荧光强度明显高于转染ATN的CHO细胞。结论 Leu99Phe突变可能不是由于影响AT与肝素的结合而导致AT缺陷,而是由于突变导致AT分泌障碍和细胞内滞留所致。 展开更多
关键词 突变 转染 抗凝血酶 分子机制 酶缺陷 CHO细胞 细胞免疫 COS7细胞 大引物 重组表达质粒
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组合突变提高重组人干扰素α2b的抗病毒活性 被引量:3
13
作者 赵广荣 杜磊 祝琳琪 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第2期347-351,共5页
本文合理设计新型重组人干扰素α2b(rh-INFα2b)基因序列,采用组合突变策略,对第52-53-55、103-107和121-125位氨基酸残基定向突变。将突变基因连接于原核表达载体pET28a上进行诱导表达,所获得的新型rh-IFNα2b的抗病毒活性效价达9.3... 本文合理设计新型重组人干扰素α2b(rh-INFα2b)基因序列,采用组合突变策略,对第52-53-55、103-107和121-125位氨基酸残基定向突变。将突变基因连接于原核表达载体pET28a上进行诱导表达,所获得的新型rh-IFNα2b的抗病毒活性效价达9.3×107IU/mg,比对照样品(1×106IU/mg)高93倍。结果表明:所采用邻近多点突变方法,有效组合了位点效应,大幅度提高了干扰素的生物活性,获得高抗病毒活性的rh-IFNα2b。 展开更多
关键词 重组人干扰素 组合突变 大引物扩增 抗病毒活性
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黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因phyA2 N-糖基化突变体的构建与表达分析 被引量:3
14
作者 殷亮 杨文竹 +4 位作者 王新宇 周蕴芝 姚斌 陈茹梅 范云六 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期54-59,共6页
为研究N-糖基化对黑曲霉Aspergillus niger963植酸酶蛋白酶学性质的影响,利用Megaprimer PCR介导基因定点突变的技术,构建了植酸酶phyA2基因两个N-糖基化突变体,即将该基因编码蛋白质N87位和N102位的天冬酰胺密码子置换为编码与其具有... 为研究N-糖基化对黑曲霉Aspergillus niger963植酸酶蛋白酶学性质的影响,利用Megaprimer PCR介导基因定点突变的技术,构建了植酸酶phyA2基因两个N-糖基化突变体,即将该基因编码蛋白质N87位和N102位的天冬酰胺密码子置换为编码与其具有相似结构的谷氨酰胺密码子,两个突变体分别命名为N87Q、N102Q,经测序结果比对和图谱分析,表明在核酸水平上成功实现了点突变,构建了酵母表达载体pPIC9-N87Q,pPIC9-N102Q,转化毕赤酵母GS115,经发酵罐水平诱导表达后,获得了N-糖基化缺失突变蛋白,对突变体蛋白在60℃进行处理发现,突变体N87Q处理1h后剩余50%的酶活,N102Q处理10min后酶活完全丧失,在37℃,不同的pH缓冲体系(pH1~10)处理1h,N87Q剩余约大于70%的活性,而N102Q在pH〉8的环境下,没有检测到酶活。 展开更多
关键词 植酸酶 N-糖基化 大引物PCR 突变体
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attB位点核心区定点突变对φC31整合酶效率的影响
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作者 李振海 谢飞 马晴雯 《医学分子生物学杂志》 CAS 2013年第2期63-68,共6页
目的考察attB位点核心区碱基突变对φC31整合酶存真核细胞中催化目的基网整合效率的影响。方法选取attB位点核心区中可能对中c31整合酶效率产生影响的碱基,设计含有相应位点突变的引物,采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB... 目的考察attB位点核心区碱基突变对φC31整合酶存真核细胞中催化目的基网整合效率的影响。方法选取attB位点核心区中可能对中c31整合酶效率产生影响的碱基,设计含有相应位点突变的引物,采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB片段,将其连人含报告基因的载体pEGFP。NI中得到pEGFP—NI—attB。以含野生型attB位点的报告基因载体pEGFP-N1-attB作为对照.将上述载体分别与中φC31整合酶表达质粒共转染HeLa细胞,经过药物筛选、染色、细胞克隆计数后,计算并比较整合效率。结果成功完成9个含有突变碱基attB位点及报告基因载体的构建。酶切及测序鉴定结果显示每个质粒含1或2个突变碱基。其中6个质粒为目标碱基突变,3个为PCR过程中随机产生的非预期突变。细胞实验结果表明,3个含有突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比无显著性差异,其余6个突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比显著降低(P〈0.05),尤其是其中两个attB位点中含有2个碱基突变的报告质粒,整合率降低极为显著(P〈0.001)。结论attB位点核心区碱基保守性较强,其中一些关键位点的突变使得整合酶效率降低。 展开更多
关键词 attB位点 点突变 大引物 整合率
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