基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法快速测定米饭和乳制品中蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide

建立基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)法分析蜡样芽孢杆菌呕吐毒素Cereulide的快速检测方法。分析了Cereulide标准物质的裂解规律,考察基质种类、点靶方式、基质溶剂和用量、激光强度等对Cereulide的质谱信号强度的影响,并进行方法学验证和实际样品检测。结果表明,选择以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质,均匀分散在50%乙腈-水(含0.1%三氟乙酸)中,采用先点基质再点样品的点样方式,反射线性正离子模式下选择激光强度70%进行食品中MALDI-TOF MS筛查时,可检测到Cereulide的[M+Na]^(+)和[M+K]^(+)目标离子峰,此质谱信号稳定、强度高、响应重复性好。方法学验证结果表明,Cereulide的[M+Na]^(+)和[M+K]^(+)目标离子峰在5~100 ng/mL范围内线性好,相关系数(r)>0.99;方法的检出限分别为3.0 ng/g和5.0 ng/g;对米饭和牛乳样品的加标回收率为73.3%~118.2%,相对标准偏差为0.3%~10.9%(n=6)。本方法分析速度快、准确性高、灵敏度好、抗干扰能力强、无需内标即可实现对米饭和乳制品中Cereulide的批量筛查和检测。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法测定α/β-二羰基类化合物与标准瓜氨酸化肽段之间的衍生化反应活性

蛋白质瓜氨酸化是一种由生物酶调控的不可逆翻译后修饰,其与免疫相关疾病、癌症、神经系统性疾病和老年痴呆症等重大疾病的发生和发展密切相关。蛋白质的瓜氨酸化修饰丰度低、缺乏亲和标签、m/z变化小且易受同位素及脱酰胺化作用干扰,因此对蛋白质的瓜氨酸化修饰进行质谱分析面临着巨大挑战。通过对瓜氨酸侧链脲基进行化学衍生反应,可以提高瓜氨酸化肽段的m/z差值,引入亲和富集标签,可有效提高瓜氨酸化分析的灵敏度和精准度。本研究以标准瓜氨酸化肽段为研究对象,以基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)为检测手段,对一系列二羰基类化合物与瓜氨酸化肽段之间的化学反应活性进行测定。在对α-二羰基类化合物的考察中发现,苯乙二醛、丙酮醛、1,2-环己二酮和1,10-邻二氮杂菲-5,6-二酮对瓜氨酸化肽段的衍生化效率很高,并且能够生成单一的衍生化产物;2,3-丁二酮、乙二醛与瓜氨酸化肽段之间的反应效率也很高,但会生成一系列副反应产物。在对β-二羰基类化合物的考察中发现,1,3-环己二酮、2,4-戊二酮在与瓜氨酸化肽段进行反应后,均可以产生单一的衍生化产物,但反应效率很低,不适用于瓜氨酸化肽段的化学衍生反应。实验结果表明,α-二羰基结构是实现高效、特异性瓜氨酸化肽段化学衍生反应的基础,α-二羰基类化合物中不同的侧链结构又决定了衍生化产物的结构、衍生化效率及副产物的生成。通过进一步合成含有亲和标签的α-二羰基类化合物,可以实现瓜氨酸化肽段的特异性富集和精准鉴定,有助于瓜氨酸化蛋白质及其位点鉴定的新方法开发。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法同时快速测定保健食品中的降压物质

建立了基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)同时快速筛查测定盐酸可乐定(HCD)、阿替洛尔(ANL)和利血平(RSP)等3种降压物质的方法。对比了不同点样方式、激光强度对3种药物信号强度的影响等因素,并进行方法学验证。结果表明,以α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)为基质,采用混合点样法,反射线性正离子模式下选择激光强度为60%进行MALDI-TOF MS检测时,3个目标物的质谱信号稳定,强度高,响应重复性好。方法学验证结果表明,3种小分子降压物质在10~100 ng/mL线性范围内线性好,相关系数(r)≥0.99,方法的筛查限(LOI)为0.005~0.25μg/g,在液体、固体和半固体3种保健食品基质中的加标回收率为67.56%~104.70%,相对标准偏差(RSDs)为0.43%~10.51%(n=3)。该方法灵敏度好,准确性高,精密度优,抗干扰能力强,有机溶剂消耗少,节能环保,尤其适用于大批量、多批次保健食品中降压物质的检测,填补了传统基质分析筛查保健食品中小分子非法添加物的空白。

ZnO、CuO和NiO纳米颗粒在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析小分子化合物中的应用

考察了过渡金属氧化物ZnO纳米颗粒直接作为无机基质,应用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法分析糖类、硬脂酸小分子物质的效果;同时以L-精氨酸为目标分析物,初步探讨了Cu O和Ni O两种纳米颗粒直接作为无机基质,对L-精氨酸选择性离子化的可行性。实验中,将待分析物与纳米颗粒悬浮液直接混合于样品板上,自然蒸干溶剂形成结晶状,采用337 nm波长的紫外激光辐照激发,在反射模式的TOF-MS条件下检测分析。结果表明,ZnO纳米颗粒作为一种半导体材料,具有较强的紫外吸收,可直接作为无机基质,能够避免使用传统基质带来的干扰,简化质谱图,尤其在负离子模式下能够提高硬脂酸离子化的峰强度。此外,通过比较Cu O和Ni O纳米颗粒对于L-精氨酸分析检测结果的差异性,初步实现了Cu+对L-精氨酸的选择性检出。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在新生儿β-地中海贫血筛查中的应用

目的建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术的β-地中海贫血(β-地贫)基因突变检测方法,探讨其在新生儿β-地贫筛查中的临床价值。方法收集新生儿脐血DNA样本515例,针对中国人群中常见的10种β-地贫基因突变类型,分别设计一套PCR引物和延伸反应引物。待测样本经PCR和延伸反应后,所得产物用Sequenom Mass Array飞行时间质谱仪进行检测,根据质谱图中的峰值确定每份样本的基因型,并用反向点杂交进行验证。结果 515份样本10个突变位点的总判读成功率为99.55%,检测结果与反向点杂交结果完全一致;共检出β-地贫14例,均为突变杂合子,阳性检出率为2.72%;其中,基因型CD41-42/N 6例,CD17/N 5例,IVS-Ⅱ-654/N 2例,CD71-72/N 1例。结论 MALDI-TOF MS技术准确性高,检测时间短,通量高,适用于新生儿β-地贫筛查。

溶菌酶基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析中的不常见修饰及脱水反应

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)分析了溶菌酶标准蛋白,在常规搜库条件下鉴定到6个独立肽段,Mascot得分420,鉴定覆盖率为54%。此外,经人工解析发现,肽段IVSDG-DGMNAWVAWR(98→112)在样品处理过程中发生了天冬酰胺脱氨化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱氨化+甲硫氨酸氧化+色氨酸氧化等修饰,在激光解吸电离过程中发生脱水反应,脱水位点是脱氨后形成的第103位天冬氨酸。此外,还发现了部分肽段的丙酰胺化修饰。本研究表明,选择一级质谱中的极低丰度离子进行串联质谱分析和利用人工解析方法分析数据库未匹配数据,有可能发现一些特殊的蛋白质修饰,可增加数据利用度和分析结果的确定性。

基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱与电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱分析蛋白质

为比较基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)和电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能,分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明,用MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其中相同的蛋白质为633种;MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质,其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明,两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性,将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可提高分析的置信度。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱在糖类化合物研究中的应用

综述了基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的发展、在糖类化合物结构研究时常选用的基质,以及在不同类型糖化合物分析中的应用。MALDI-TOF-MS在糖类分析中通常采用的是N2激光源,基质多为有机小分子如2,5-二羟基苯甲酸、2,4,5-三羟基苯乙酮、1-羟基异喹啉或2-羟基-5-甲氧基苯甲酸、α-氰基-4-羟基-苯丙烯酸等,基质类型的选择则要取决于糖类的存在形式。糖类化合物如中性糖、酸性糖、硫酸化糖、糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂等均可利用适合的基质而进行MALDI-TOF-MS分析。

基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法分析人乳β-酪蛋白新生儿体外消化模型多肽组

通过体外模拟新生儿消化道条件,用基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱法（MALDI-TOF/TOF）探究人乳β-酪蛋白消化后的多肽组。在离子源加速电压为20 k V,激光波长337 nm,激光频率200 Hz,离子延迟提取时间330 ns,质谱信号单次扫描累加2000次条件下,扫描质量范围m/z 500~5000的肽段。结果表明,消化后得到26个肽段,分子量集中在1000~4000 Da。与已知功能的肽段序列进行对比,人乳β-酪蛋白在新生儿体外模型消化后未产生与已知功能的活性肽序列匹配的肽段,但发现9个肽前体,其中含4个血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽前体,2个酪蛋白磷酸肽（CPP）前体,2个抗氧化肽前体,1个免疫活性肽前体,由酶切位点推测分析,肽前体可以继续在蛋白酶作用下转化为生物活性肽。

3-氨基喹啉在基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测定聚合物中的应用研究

采用3-氨基喹啉(3-AQ)为基质,利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对合成的一种广泛应用于生物材料、抗菌等领域的聚合物生物碱进行了测定。结果表明:3-AQ能高效解吸/电离此种类型高分子聚合物,获得了合成目标物的分子量分布、重复结构单元及末端基结构等信息,为目标物的合成反应条件的优化和反应机理的推导提供确凿依据。3-AQ可成为MALDI-TOF-MS分析聚合物基质的新选择。

联合磁性微球和基质辅助的激光解吸/离子化-飞行时间质谱筛选肾细胞癌血清差异蛋白

目的采用联合磁性微球和基质辅助的激光解吸/离子化-飞行时间(MALDI-TOF-MS)技术筛选肾细胞癌患者血清差异蛋白峰。方法采用弱阳离子磁性微球从99份血清标本(肾细胞癌62份,肾脏良性占位病变37份)捕获血清蛋白,MALDI-TOF-MS质谱仪检测蛋白峰,Biomarker Wizard 3.1和Biomarker Patterns Software 5.0分析数据,以47例肾细胞癌及26例肾脏良性占位病变标本建立肾细胞癌诊断模型,15例肾细胞癌和11例肾脏良性占位病变标本进行盲法验证。结果发现7个蛋白峰具有统计学差异(P<0.05),以质荷比2945.35、15340.8、6984.51、5819.23的4个蛋白峰建立肾细胞癌诊断模型,该模型区分肾细胞癌与肾脏良性占位病变的敏感性为83.0%,特异性为84.6%;盲法验证,该模型诊断肾细胞癌的敏感性为80.0%,特异性为81.8%。结论采用磁性微球与MALDI-TOF-MS技术可以检测肾细胞癌血清中的差异蛋白峰,并建立敏感性、特异性较高的肾细胞癌诊断模型。

糖基转移酶反应的基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法监测

以wabD(大肠杆菌O77中O抗原基因簇内)编码的α-1,3-甘露糖转移酶、wfgD(大肠杆菌O152中O抗原基因簇内)编码的β-1,3-葡萄糖转移酶和wfeD(志贺氏菌鲍氏O14中O抗原基因簇内)编码的β-1,4-半乳糖基转移酶酶促反应产物为研究对象,尝试应用碰撞诱导解离(CID)负离子模式基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术建立简单、高效的糖基转移酶监测方法。该方法首先直接用质谱分析0.3μL未经色谱分离、除盐处理的反应混合物,随后应用CID串联质谱技术对酶活反应产物进行结构表征,实现酶活反应的快速检测。研究结果表明,CID MALDI-TOF MS平台适用于新建克隆的糖基转移酶酶活反应的监测,与现有的高通量方法相比,在速度、灵敏度、重现性、自动化和溶剂消耗方面具有绝对优势。

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱鉴定鲨鱼硒结合蛋白

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了原核表达的白鳍鲨硒结合蛋白。实验表明,硒结合蛋白肽段之一被错误指认为胰酶自水解峰和混合谱是影响其未进行串联质谱分析或不能被数据库搜索匹配的主要原因,同时还发现,虽然赖氨酸结尾肽段在MALDI源中信号强度普遍很低,但对它们进行串联质谱分析也可获得较好的谱图质量,部分数据可用于从头测序。考虑以上因素后,硒结合蛋白鉴定覆盖率由35%增至51%。

谷氨酸甲基化修饰的基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了枯草芽孢杆菌中的蛋白酶抑制剂和杆菌肽F两种蛋白及其翻译后修饰,发现在这两种蛋白质中共有5个肽段发生谷氨酸甲基化,其中肽段FELVVYDSEHK存在FE(Methylation)LVVYDSEHK和FELVVYDSE(Methylation)HK两种形式。结果表明,MALDI-TOF/TOF高能CID所提供的丰富断裂信息和全质量范围扫描对提高分析结果的确定性具有重要作用。此外,这5个甲基化肽段都可以检测到相对含量更高的非甲基化肽段,这为降低分析结果的假阳性提供了辅助判据。在低质量区检测到甲基化赖氨酸的亚胺相关离子m/z 98和143,说明发生了赖氨酸的甲基化;检测到m/z 116则提示发生了谷氨酸甲基化。

以2-氨基-5-硝基噻唑为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的有效基质分析DNA及蛋白质样品

采用碱性新基质 2 -氨基 -5 -硝基噻唑对 DNA和蛋白质样品进行了基质辅助激光解吸 /电离飞行时间质谱分析 .结果表明 ,2 -氨基 -5 -硝基噻唑能有效地解吸电离 DNA和蛋白质样品 .采用正离子检测模式 ,分析分子量小于 5 0 0 0的 pd( T) 1 0 ,pd( C) 1 0 ,pd( A) 8,pd( G) 1 0 和 pd( 5′ATC GAT CGA T3′) DNA样品时 ,分辨率均可达到 1万以上 ;与分析 DNA样品的常用基质相比 ,2 -氨基 -5 -硝基噻唑解吸 /电离样品分子所需要的激光强度小 ,易于获得信噪比和分辨率高及重复性好的谱图 ;分析蛋白质胰岛素、细胞色素 C及牛血清白蛋白样品能达到与α-氰基 -4-羟基肉桂酸 ( HCCA)和 3 ,5 -二甲氧基 -4-羟基肉桂酸 ( SA)相同的效果 .采用负离子检测模式则能以较高的信噪比获得分子量达到 70 0 0的 DNA的分子离子峰信号 .此外 ,以 2 -氨基 -5 -硝基噻唑为基质的基质辅助激光解吸 /电离 ( MALDI)

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱在高分子研究中的应用

在质谱学的发展过程中,如何获得大分子物质的质谱信息一直是最具有挑战性的课题。在过去的20年里,大分子的质谱研究取得了很大进展,发展出快原子轰击(FAB)、液质联用(LC-MS)、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)以及质谱/质谱串联(MALDI-TOF/TOF)等技术,并在生物大分子的结构测定、高聚物的结构及端基测定、共聚物的序列结构及组成等方面对高分子科学的发展作出了突出贡献。本文结合具体实例着重介绍了MALDI-TOF MS在大分子分析中的技术优势及应用。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法检测罕见单糖合成酶

以VioF(普罗威登斯菌O30中O抗原基因簇内)编码的甲酰基转移酶酶促反应产物为研究对象,采用碰撞诱导解离(CID)负离子模式基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术建立简单、高效的罕见单糖合成酶监测方法。本方法首先直接质谱分析0.3μL未经色谱分离、除盐处理的酶促反应混合物,随后应用CID串联质谱技术对酶活反应产物进行结构表征,实现酶活反应的快速监测。结果表明:高能CID MALDI-TOF/TOF-MS平台适用于新建克隆的单糖合成酶酶活反应的监测,与现有的监测方法相比,在速度、灵敏度、重现性、自动化和溶剂消耗方面具有绝对优势。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌鉴定及同源性分析中的应用

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对我院血流感染样本中醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌的鉴定及同源性分析中的应用。方法收集2011年4月—2015年4月我院非重复血流感染标本,对VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪初步鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌的菌株,开展基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,用MALDIBiotyper软件和ERIC-PCR进行同源性分析,并用16S r RNA及rec A基因测序技术进行验证。结果基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对20株VITEK 2无法鉴定到种的醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌展开了有效的鉴定,其中9株为医院不动杆菌(Acinetobacter nosocominalis),11株为皮特不动杆菌(Acinetobacter pittii),两种细菌的质谱图中均含有特异性的峰图,能有效地将两类细菌进行区分。同源性分析结果将菌株分为2大簇(I型11株,II型9株),II型又分为3小簇(IIa4株,IIb3株,IIc2株)。I型、II型分布在我院4个病区。结论基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合菌鉴定方面具有精准、快速的优点,可以鉴别出皮特不动杆菌和医院不动杆菌,MALDI-Biotyper软件进行同源性分析十分便捷。

3-氨基-9-乙基咔唑衍生化寡糖混合物的高效液相色谱分离及激光解吸电离飞行时间质谱分析

建立了以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)为衍生化试剂对寡糖的标记方法。寡糖的还原端与AEC的伯氨基反应生成烯胺,再被NaBH3CN还原为二级胺,使得寡糖被AEC标记。衍生物通过反相高效液相色谱分离纯化,采用的色谱柱为Waters Symmetry C18柱(3.9mm×150mm,5μm),乙腈和乙酸铵水溶液(pH4.5)为流动相,梯度洗脱,在254nm波长处检测,并以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析。在此衍生化条件和色谱条件下,葡寡糖衍生物分离良好,并且AEC衍生可显著提高葡寡糖的质谱检测灵敏度。该方法适用于寡糖的分离纯化和结构分析,并与生物质谱具有良好的兼容性,表明该方法在微量寡糖链分析方面有广阔的应用前景。