大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析

磷酸丙糖异构酶(TPI)是生物体糖酵解的一种关键酶,对大片吸虫获取能量而赖以生存有着十分重要的作用。本试验根据肝片吸虫TPI(GenBank:KC164346.1)的基因序列,设计带有BamHⅠ和XhoⅠ作为酶切位点的引物,以大片吸虫的cDNA为模板,扩增大片吸虫磷酸丙糖异构酶(FgTPI)基因。结果:FgTPI基因开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸,理论等电点pI为8.07;构建的重组表达质粒FgTPI-pET-28a(+)成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白的分子量约为32 kDa;重组蛋白免疫BALB/c小鼠,收取多克隆抗体,ELISA检测结果显示,rFgTPI能诱导较高的IgG抗体水平;用感染大片吸虫动物的血清检测重组蛋白的免疫原性,Western blot分析表明,重组蛋白rFgTPI具有良好的免疫原性;生物信息学预测显示,FgTPI主要以α螺旋和β折叠为主,β转角较少,有3个较长的无规则卷曲;通过α-磷酸甘油脱氢酶偶联法测定其活性,发现FgTPI酶促反应最佳pH值为7.5,最适温度为35℃。本试验结果为深入研究FgTPI的生物学功能、评价其作为抗大片吸虫病疫苗候选分子奠定了基础。

水牛感染大片吸虫前后血清补体C3与C4水平的动态

为了探究在大片吸虫(Fasciolagigantica)感染水牛过程中,水牛补体C3与C4的动态变化,探索补体系统在水牛感染大片吸虫中的作用过程,试验将6头片形吸虫阴性水牛分为A组(对照组,3头)和B组(感染组,3头),B组每头经口感染250个囊蚴,A组经口服0.85%NaCl溶液模拟感染,在感染前(0周)与感染后第1~6、8、10、12、14、16周分别收集血清,应用ELISA检测血清补体C3与C4含量。结果表明:对于补体C3水平,A组不同周次无明显变化;B组不同周次呈波动变化,与0周相比1、12、14周显著升高(P<0.05);B组在感染后1、3、14、16周的水平显著高于A组对应周次的水平(P<0.05)。对于补体C4水平,A组不同周次无明显变化;B组不同周次呈波动变化,与0周相比感染后周次均极显著升高(P<0.01);B组在感染后1、3、4、5、12、14、16周的水平显著高于A组对应周次的水平(P<0.05)。本研究提示:在大片吸虫感染过程中,水牛补体的经典途径和凝集素途径在不同周次可能被大片吸虫抑制,而此抑制作用可能与大片吸虫的免疫逃避有关。

广西钦州市郊区水牛大片吸虫感染情况调查分析

为了掌握广西钦州市郊区水牛大片吸虫感染情况,采用ELISA方法测定了从钦州市屠宰场随机抽样采集的70份水牛血清样品。结果表明,70份水牛血清样品中有27份血清大片吸虫抗体呈阳性,阳性率为38.57%;各年龄段水牛均有大片吸虫感染,最小年龄为2岁,最大为12岁,但主要集中在2～8岁的水牛群体;雄性水牛阳性感染率为14.29%,雌性水牛阳性感染率为24.29%。说明广西钦州市郊区水牛受大片形吸虫危害较严重,这与当地水牛多以散养方式进行饲养有关。最后提出今后防制该病的相关措施及工作重点,以期为当地水牛产业的科学饲养管理及优质奶水牛养殖基地的建设提供科学指导。

抗大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体制备及其生物学特性鉴定

【目的】制备大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体,为大片吸虫病的免疫诊断、防治等研究奠定基础。【方法】利用杂交瘤技术,以大片吸虫分泌排泄抗原为免疫原制备单克隆抗体,并用ELISA、硫氰酸盐洗脱法等方法鉴定其生物学特性。【结果】通过间接ELISA筛选及3次亚克隆后,共获得5株大片吸虫分泌排泄抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6D3、6B4、7D2、7D1和7D4。经鉴定,发现5株杂交瘤细胞染色体数为90～110条,均大于亲本细胞,其亚类鉴定分别属于IgG2b、IgM、IgM、IgG1和IgM,其轻链均为κ型;5株单克隆抗体(6D3、6B4、7D2、7D1、7D4)的上清效价分别为1:400、1:3200、1:25600、1:6400和1:6400,腹水效价分别为1:104、1:104、1:105、1:107和1:106;而表位测定结果表明,5株单克隆抗体中,6D3与7D1、7D2以及7D4与7D1、7D2作用于不同表位,6D3与6B4可能识别同一表位或重叠表位,或同一表位有空间位阻,7D4与6D3以及6B4与7D4、7D1、7D2可能具有空间位阻;5株单克隆抗体的相对亲和力为:6B4>7D4>7D1>6D3>7D2;5株杂交瘤细胞株均能稳定地分泌单克隆抗体。【结论】制备获得的分泌排泄抗原单克隆抗体可用于大片吸虫病的诊断和免疫机理等方面的进一步研究。

大片吸虫成虫cDNA表达文库的构建及其表达序列标签初步分析

为发现潜在的抗大片吸虫病的候选疫苗分子,控制大片形吸虫病,本研究以大片吸虫成虫为材料,应用SMARTTcDNA文库构建技术,构建了以表达载体λTriplEx2为基础的大片吸虫成虫cDNA表达文库。经测定,库容量为1·08×106PFU/ml ,重组率为96·6 %,扩增后的文库滴度为2·41×109PFU/ml ,插入片段平均大小约为1 000 bp;经大肠杆菌BM25·8质粒化后,从文库中随机挑选40个重组克隆测序,获得32条有效ESTs ;经BLASTX和BLASTn程序检索和分析,发现有9条ESTs代表已知基因, 16条ESTs相似性较低或无匹配,列为新基因。9条已知基因代表了半胱氨酸蛋白酶、卵壳蛋白、钙连接蛋白等三类功能蛋白,其余新基因也暗示与信号传导、蛋白合成、免疫刺激等基因相关,具有潜在的研究价值[动物学报51 (5) : 879 -883 , 2005]。

应用LD-PCR法构建大片吸虫成虫cDNA表达文库

为构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,用Trizol试剂提取大片吸虫成虫总RNA,经反转录合成cDNA第一链,应用LD-PCR扩增方法,合成双链cDNA。用SfiⅠ内切酶修饰此双链cDNA,使形成两端分别带有SfiⅠA和SfiⅠB的黏性末端。经CHROMA SPIN-400柱纯化,收集400 bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有SfiⅠA和SfiⅠB末端的λTriplEx2噬菌体载体,经体外包装后,以XL1-Blue为受体菌构建cDNA表达文库。经测定,库容量为1.08×106PFU/mL,重组率为96.6%。扩增后的文库滴度为2.41×109PFU/mL,插入片段平均大小约为1 000 bp。这些结果表明已成功构建大片吸虫成虫cDNA表达文库,适合进一步筛选大片吸虫新基因。

绵羊和水牛实验感染大片吸虫后外周血白细胞计数的分析

对绵羊和水牛在感染大片吸虫后外周血白细胞总数计数和白细胞分类计数(嗜酸性细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、淋巴细胞和单核细胞)的特性进行研究。结果表明,绵羊对大片吸虫很不易感,水牛对大片吸虫很易感。未感染绵羊和水牛的白细胞总数有较大的差距,分别为5 956(±825)个细胞/mm3血液和12 657(±1 053)个细胞/mm3血液。未感染绵羊和水牛的嗜酸性细胞占白细胞总数的百分比小于5%。淋巴细胞占的比例最大,绵羊为59.5%,水牛达70.8%。感染绵羊和未感染绵羊的白细胞总数、嗜酸性细胞计数在感染过程中总体上存在显著差异,感染后绵羊的嗜酸性细胞的数量迅速升高,在感染后4周(4W P I)达到高峰。而感染水牛和未感染水牛白细胞总数差异不显著,但嗜酸性细胞存在显著差异,感染后水牛的嗜酸性细胞的数量升高缓慢,到8 W P I达到高峰。结果提示嗜酸性细胞在感染绵羊中更加有效地参与了杀灭大片吸虫。

大片吸虫成虫FG0018表达序列标签序列的电子克隆分析及实验验证

用大片吸虫成虫FG0018表达序列标签(Expressed Sequence Tags,ESTs)序列对NCBI数据库进行Blastn比较,采用生物信息学方法,运用网上数据库资源,结合相关生物信息学软件将目标序列进行搜索、处理、拼接、延伸,得到的最后重叠群(contig,命名为FG0018C0N)与肝片吸虫卵壳蛋白B2序列(GenBank:M93025)相似性很高,用DNASTAR、SEQMAN程序和Blast2程序分析FG0018C0N,推测其开放阅读框为930 bp,编码310个氨基酸,蛋白质的特点及跨膜区预测其编码蛋白可能属于核蛋白,疏水性分析表明其编码一疏水蛋白。FG0018C0N基因与肝片吸虫卵壳蛋白基因有100%的相似性,310个氨基酸与之有91%的一致性。经RT_PCR、酶切验证并cDNA测序,结果证明FG0018C0N序列可能是大片吸虫的卵壳蛋白基因。

水牛实验感染大片吸虫及ELISA检测特异性抗体的变化

目的 本试验为了对水牛感染大片吸虫的情况进行了解。方法 选 10头 6月龄水牛 ,分成 2组 ,每组 5头 ,A组对照 ,B组试验 ,每头经口感染 2 5 0个大片吸虫囊蚴。结果 水牛感染大片吸虫后的收虫率为 16 .2± 8.0 % ,在感染后第 13～ 14周检出虫卵。抗大片吸虫分泌排泄产物 Ig G水平从感染后第 2周明显升高 ,17周时达到高峰。结论 试验证实水牛对大片吸虫感染很敏感 ,EL

大片吸虫组织蛋白酶L全长序列的获取及其生物信息学分析

根据文库载体序列与原组织蛋白酶表达序列标签(EST)设计引物,以大片吸虫cDNA文库为模板,进行Touchdown PCR与梯度PCR相结合的扩增反应,扩增产物克隆入pMD18-T载体,经鉴定后测序,并采用生物信息学技术对序列进行开放阅读框(ORF)、编码氨基酸序列、蛋白质同源性比较、二级、三级结构等分析;结果所获序列全长990 bp,编码330个氨基酸,分子量36771.2 u,等电点5.44;具有较明显的螺旋、片层和无规卷曲等二级结构,α螺旋占17.3%,β折叠占27.0%,无规卷曲占55.8%;具有2个较明显的跨膜区和2个疏水区,未发现明显的信号肽和糖基化位点;氨基酸序列同源性比对显示其属于半胱氨酸家族;三级结构同源建模预测显示其与组织蛋白酶K(PDB number 2f7dA)有49%的一致性。

抗大片吸虫ES抗原单克隆抗体的制备及特异性鉴定

用大片吸虫分泌排泄 (ES)抗原免疫BALB/c小鼠 ,取其脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经筛选和 3次克隆化培养后获得 2株分泌抗大片吸虫ES抗原单抗的杂交瘤细胞 (F5,F9)。经传代、冻存、复苏培养检测和染色体检查 ,证实其分泌单抗的性质稳定。通过间接ELISA试验证明 ,F5和F9单抗能与大片吸虫、肝片吸虫的ES抗原发生特异性反应 ,而不与它们的虫体抗原反应。SDS PAGE电泳和Western blot显示 ,F5McAb能与ES抗原的相对分子质量为 2 6 0 0 0～ 2 80 0 0的蛋白条带反应 ,而不与其可溶性虫体抗原反应。表明F5McAb有ES抗原特异性 ,是一株具有潜在诊断价值的McAb。

不同方法及材料检测大片吸虫感染的比较试验

为片形吸虫病诊断提供高效、简便的新技术，以大片吸虫分泌排泄抗原（ES抗原），用于斑点酶联免疫吸附试验（Dot－ELISA）、琼脂扩散酶联免疫吸附试验（Dig－ELISA）、免疫胶体金滴渗法（DIGFA）检测动物体内的大片吸虫（Fasciolagigantica）感染。通过检测血清、血纸、牛奶等几种材料，多重试验比较，结果三种方法均具有敏感性高、特异性强、准确性可靠等优点，并各有特长，如操作简便快速、费用低廉，易于在基层推广应用等，同时证明用血纸和牛奶检测抗体效果同样可靠。本试验首次报道用Dot－ELISA、DIGFA在奶中检测片形吸虫抗体，为该寄生虫病普查提供一种新思路。

用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶的研究

为了探明大片吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）的多肽组分和酶活力，以供今后进行ＧＳＴ的免疫原性和各种蠕虫ＧＳＴ的交叉免疫原性的研究，本试验首次用亲和层析法对大片吸虫ＧＳＴ进行提取，用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析了大片吸虫ＧＳＴ的多肽组分，用１－氯－２，４－二硝基苯（ＣＤＮＢ）为底物测定了ＧＳＴ酶活力。电泳染色结果表明，大片吸虫ＧＳＴ至少有２条带，其分子量为２９．９～２４．５ＫＤ，其中主带２条，分别为２８．３、２６．２ＫＤ。酶活力测定结果表明，提取的ＧＳＴ可获得１０．４４μｍｏｌ／Ｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上的酶比活性。

免疫印迹分析试验感染肝片吸虫和大片吸虫绵羊的IgG应答

免疫印迹(Westernblot)分析试验感染肝片吸虫和大片吸虫绵羊的抗片形吸虫分泌排泄产物(FhESP和FgESP)IgG应答,结果表明,FhESP中分子质量在17.1～21.6ku之间的4条主要蛋白带仅被肝片吸虫感染以后(0WPI以后)的血清识别且不被对照组血清识别;FgESP中分子质量在19.0～71.1ku之间的6条主要蛋白带仅被大片吸虫感染以后(0WPI以后)的血清识别且不被对照组血清识别。

大片吸虫成虫体被结构的扫描电镜和透射电镜观察

目的了解大片吸虫的超微结构特征并分析其功能。方法采用扫描电镜技术对大片吸虫的成虫体表超微形态结构进行连续观察,应用透射电镜对大片吸虫的体被组织结构进行观察。结果大片吸虫虫体体表覆盖有体棘,体棘的前端分叉成锯齿状;虫体的感觉乳突有的呈多个聚集分布,而有的为单个分布。透射电镜下,虫体可分为体被、肌层和细胞体层。体被为一合体层,厚度约25μm,包括外质膜、基质和基底膜;基质富含分泌颗粒、线粒体、空泡。体被的最外层观察到糖萼和质膜凹陷,可能与虫体的免疫逃避和营养吸收有关。肌层分布有环形和纵行两种肌肉,肌肉层的肌肉间隙和原生质管可能是输送营养物质的通道,质管内的分泌颗粒和小空泡可能为主要的营养物质。细胞体层内细胞核清晰,细胞质内有线粒体、胞质空泡和分泌颗粒。结论大片吸虫成虫体被可能是成虫逃避免疫攻击和营养吸收的重要部位。

大片吸虫感染水牛对宿主增重影响的初步研究

试验初步研究大片吸虫感染水牛对宿主增重影响。 1 0头 1 0 -1 2月龄本地与摩拉或尼里杂交一代水牛分为A、B两组 ,A组 5头作对照 ,B组5头每头经口感染 2 5 0个大片吸虫囊蚴。感染前和感染后每月称重一次。从感染后第 1 0 -1 9周检查大片吸虫虫卵。结果表明 ,水牛感染大片吸虫后第 1 4周检出虫卵。对照组水牛从感染后第0 -4个月的平均增重分别为 0 0 ,2 2 6,40 6,5 1 8和 72 6;感染组水牛的同期增重为 0 0 ,1 4 6,2 7 0 ,3 5 2和 5 2 6千克 ;感染组的增重从感染后第 2个月开始至感染后第 4个月 ,两组的增重有显著性差异 (P 0 0 5 )。

用亲和层析法提取大片吸虫谷胱甘肽转移酶

为了探明大片吸虫谷胱甘肽转移酶（GST）的多肽组分和酶活力以供今后进行 GST 的免疫原性和各种蠕虫 GST 的交叉免疫原性的研究,本试验首次用亲和层析法对大片吸虫谷胱甘肽转移酶（GST）进行提取,用 SDS-PAGE 分析了大片吸虫谷胱甘肽转移酶（GST）的多肽组分,用1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）为底物测定了 GST 酶活力.电泳染色结果表明,大片吸虫谷胱甘肽转移酶（GST）至少有2条带,其分子量为29.9～24.5kD,其中主带2条,分别为28.3和26.2kD。酶活力测定结果表明,提取的 GST 可获得10.44μmol·min-1·mg-1以上的酶比活性.

广西大片吸虫病诊断及患者周边人畜感染和植物污染情况调查

目的对1例片形吸虫感染病例进行诊断并对患者周边人畜环境污染情况进行调查,为人片形吸虫病的诊断及防控提供依据。方法对1例疑似人片形吸虫病病例进行虫卵形态学鉴定及ITS2基因序列分析,并对患者周边人群、水牛、中间宿主螺以及可能感染的水生植物进行调查。结果经虫卵形态学鉴定和虫卵DNA ITS2基因序列分析,确诊了该患者为大片吸虫感染。患者经三氯苯达唑驱虫治疗后症状消失,2个月后复诊虫卵检测为阴性。对患者周边人群、水牛、小土蜗螺和水浮莲调查发现,除在牛粪中发现虫卵外,其他未发现感染。结论确诊1例人大片吸虫感染病例,但是患者周边未发现有其他人感染,可能是通过接触水生植物不慎摄入污染的囊蚴而感染。

大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及免疫原性分析

构建大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(Fg.TPx)原核表达质粒,经大肠埃希菌Rosetta表达融合蛋白(Fg.TPx/His)并对其进行纯化和初步鉴定。PCR扩增Fg.TPx的基因片段,亚克隆至pET32a(+)中构建重组表达载体pPET32a-Fg.TPx。IPTG诱导表达,经镍离子亲和层析分离纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。重组质粒经限制性内切酶双酶切和测序分析表明构建成功,表达产物以可溶性和包涵体形式存在,纯度为90%,Wsetern blot证实该蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量为TPx和His分子质量之和,表明是融合蛋白。重组蛋白可以被大片吸虫感染水牛阳性血清特异性识别。免疫家兔产生的抗体效价最高可达1∶4 000。成功构建了p ET32a-Fg.TPx原核表达质粒,重组蛋白得到高浓度表达,具有抗原性,为进一步研究其在大片吸虫病诊断中的应用奠定了基础。