应用多重PCR-变性高效液相色谱技术检测大片段重复或缺失突变

目的探讨多重PCR-变性高效液相色谱（PCR-denature high performance liquid chromatography，PCR—DHPLC）技术在假肥大型肌营养不良症和脊肌萎缩症外显子拷贝数异常检测中的应用价值。方法应用多重PCR-DHPLC方法筛查35例假肥大型肌营养不良症患者和6例脊肌萎缩症患者。选择阳性对照和阴性对照进行方法学可靠性检验。结果多重PCR-DHPLC可完全检测出全部阳性对照中重复或缺失片段。35例假肥大型肌营养不良症样本中检测出5例大片段重复，20例大片段缺失，突变检出率为71．4％。6例脊肌萎缩症患者均检测到第7外显子缺失。结论多重PCR-DHPLC分析系统可作为有效筛查大片段重复或缺失突变的检测方法。

精子线粒体基因片段缺失及点突变与弱精症相关性研究进展

弱精症是导致男性不育的主要因素之一,然而其发病机制尚待研究。近年来,线粒体的研究在生殖领域逐步开展,mt DNA与人类男性不育症的相关性研究己成热点。一系列研究发现线粒体基因片段缺失如4977bp等以及发生在POLG、ND4、t RNA、ATPase6等线粒体基因上的点突变与弱精症存在相关性。为进一步阐述弱精症的分子机制,明确弱精症的诊断和靶向治疗提供依据。

多重竞争性荧光PCR检测X连锁Alport综合征大片段缺失突变

目的:探讨多重竞争性荧光PCR在X连锁Alport综合征分子诊断中的应用。方法:选择20例在北京大学第一医院确诊且未进行基因诊断的X连锁Alport综合征患者为研究对象,同时选择2例经多重连接依赖性探针扩增技术检测到COL4A5基因大片段缺失突变的患者作为阳性对照和1例经肾活检组织电子显微镜检查证实非Alport综合征的男性作为正常对照。首先应用多重竞争性荧光PCR技术扩增COL4A5基因53个外显子和4个参照基因,对于检测到COL4A5基因缺失第1外显子者,进而应用相同技术扩增COL4A5基因外显子1~4、COL4A6基因外显子1~4、两基因共用启动子以及3个参照基因;对于检测到拷贝数缺失者,应用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增后的PCR产物或直接测序。结果:两例阳性对照应用多重竞争性荧光PCR技术检测到的COL4A5基因缺失突变与应用多重连接依赖性探针扩增技术检测到的COL4A5基因缺失突变一致。20例患者中6例(30%)明确了基因型,其中2例患者具有累及COL4A5和COL4A6两个基因5'端的大片段缺失,2例患者具有累及COL4A5基因30个外显子以上的大片段缺失,1例患者具有累及COL4A5基因至少1个外显子的大片段缺失,1例患者具有COL4A5基因缺失13个碱基的小的缺失突变,未检测到重复突变。结论:多重竞争性荧光PCR技术可用于检测X连锁Alport综合征大片段缺失突变,是对该病分子诊断检测方法的重要补充。

重复引物PCR技术在超大片段动态突变疾病基因检测中的应用

动态突变疾病是指基因编码区或非编码区发生核苷酸重复序列异常扩增所导致的一类遗传性疾病。发生于非翻译区的动态突变常常伴有超大片段重复序列,应用普通PCR法无法对该片段进行扩增,而传统的Southern blot等技术费时费力,无法应用于临床基因诊断。在此背景下,重复引物PCR技术应运而生,并随着应用范围的扩大而逐渐改进,适用于强直性肌营养不良症、Friedreich共济失调、脊髓小脑性共济失调10型及C9orf72基因突变引起的额颞叶痴呆或肌萎缩侧索硬化等遗传性动态突变疾病的临床基因检测。文章简要介绍了重复引物PCR技术的原理,着重阐述了重复引物PCR技术在相关超大片段动态突变疾病临床基因检测中的应用进展。

USH2A基因大片段重复等突变导致中重度听力损失

目的寻找并确定2例中重度听力损失家系的临床表型和分子病因,为该家庭生育提供遗传指导。方法通过家系调查,临床检查和遗传学特征的分析和应用包含406个靶向耳聋基因高通量测序筛选出候选致病病因,再利用Sanger测序验证USH2A致病突变和荧光定量PCR检测USH2A中的大片段重复序列插入突变。结果先证者均中重度听力损失,发现USH2A c.8559-2A>G(p.(Try2854_Arg2894del))和USH2A c.dup(exon37-39)复合杂合突变是J193家系的致聋突变;USH2A c.9570+1G>A(splicing)和USH2A c.5581G>A(p.G1861S)复合杂合突变是J195家系的致聋突变。结论目标区域捕获结合二代测序技术为具有高度遗传异质性的耳聋个体及家庭提供了有力的检测手段。采用该方法成功为J195家系和J193家系明确了致聋突变,其中USH2A c.8559-2A>G、USH2A c.9570+1G>A、USH2A c.5581G>A是已报道的致聋突变,而USH2A c.dup(exon37-39)是目前USH2A首个被报道的大片段基因组重复插入致病突变,丰富了该基因的遗传突变类型和图谱。

北方汉族31个X染色体短串联重复片段突变及遗传多态性研究

【目的】调查31个X-STR基因座在中国北方汉族的遗传多态性、连锁不平衡情况和突变率。【方法】采集209个中国北方汉族健康志愿者家系样本,用MicroreaderTM 19X和AGCU X19 STR荧光检测试剂盒检测,统计基因座的突变率。选取家系中父亲或母亲各207个样本,组成男性和女性无关个体组并进行遗传多态性研究和连锁不平衡检验。【结果】共检出344个等位基因,基因频率分布在0.0016-0.8100之间。其中多态性信息含量最丰富的基因座是DXS10135(PIC=0.9124)。个体识别能力在男、女群体中分别为0.3305-0.9181、0.5340-0.9876。累积个人识别概率在男、女群体中分别为1-4.5664×10^(-19)、1-1.5784×10^(-31)。平均排除概率在三联体和二联体中分别为0.3127-0.9124、0.1935-0.8446。累积平均排除概率在三联体和二联体中分别为1-2.2819×10^(-17)、1-2.5090×10^(-12)。经分析,有1对X-STR(DXS10103-DXS10101)存在明显连锁不平衡现象。在414次减数分裂中观察到19个X-STR基因座有突变,平均突变率为0.0023,突变率最高的基因座是DXS10135,为0.0121。【结论】获得的31个X-STR遗传学数据为法医学鉴定提供了基础数据。DXS10103-DXS10101存在连锁不平衡,在应用时需按照单倍型频率分析。应用高突变率基因座时需保持谨慎,不要因为个别基因座不符合遗传规律而排除具有某种亲缘关系。

纤溶酶原Kringle5缺失突变体抑制血管内皮细胞增生的研究

目的纤溶酶原蛋白水解片段Kringle 5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值,但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mut1)并检测其体外活性。方法除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以降低其相对分子质量,但同时保留K5分子中的所有3个二硫键以保留完整的外环结构域,并在大肠杆菌中表达,亲和层析纯化,获得突变型K5 Mut1 (Cys1-80);MTT法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞和周皮细胞的抑制作用。结果K5 Mut1以浓度依赖的方式抑制原代培养的视网膜内皮细胞,EC50(抑制50%细胞增生的药物浓度)约为35 nmol/L,是完整K5活性的2倍。在同样浓度范围内,K5 Mut1并不抑制同源的周皮细胞,表明K5 Mut1特异性抑制血管内皮细胞增生。结论K5 Mut1是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子,在糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。

HCV核蛋白羧基端信号肽基因缺失突变体的构建、鉴定和真核表达

目的:构建羧基末端缺失核蛋白的真核表达载体并在小鼠肥大细胞瘤细胞株P815细胞中表达.方法:用RT-PCR方法从西安地区丙型肝炎患者血清中扩增HCVC区及部分E1区基因并进行克隆、测序,以此为模板扩增羧基末端缺失突变核蛋白基因片段(C507),将其定向克隆入真核表达载体pCI-neo中并转染P815细胞,经间接免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜检测细胞中突变核蛋白(P169)的表达.结果:从患者血清中成功克隆出HCVCcDNA,构建了编码羧基末端缺失核蛋白的重组质粒pCI-507,并经酶切鉴定和测序证实;间接免疫荧光染色表明P169主要在P815细胞胞质中表达,少数可见于细胞核内.结论:重组体pCI-507构建正确,其表达产物P169在P815中得到有效表达,为在此基础上的DNA免疫研究提供了实验依据.

一种小片段缺失型β地中海贫血的血液学特征分析和产前诊断

目的分析一种因β珠蛋白基因小片段缺失所致的β地中海贫血患者的血液学特征,并对3个家系实行地中海贫血的产前诊断。方法应用血红蛋白电泳和血常规检测对所有采集的外周血标本进行血液学指标分析,使用PCR-流式荧光杂交法和sanger测序的方法进行地中海贫血的基因诊断和产前诊断。结果基因检测一共发现7例HBB:c.268_281delAGTGAGCTGCACTG(CD89-93-14bp)杂合突变的β地中海贫血携带者,表现为与常见β0地中海贫血相似的小细胞低色素性贫血。3个家系的产前诊断结果显示2例为这种小片段缺失突变的携带者,1例未遗传到父母的突变基因型。结论上述小片段缺失是一种导致β0地中海贫血的移码突变,这种突变不包含在临床上常见的17种β地中海贫血突变基因检测范围内。当其复合其他β珠蛋白突变时可引起中重型β地中海贫血,所以精确诊断此种突变对产前诊断和遗传咨询具有重要价值。

减毒炭疽芽胞杆菌inhA基因缺失突变株的构建及鉴定

炭疽（anthrax）是一种人畜共患的急性烈性传染病,其病原菌是炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）,属于革兰氏阳性菌。炭疽病是世界公认的五大人畜共患病之一,由于炭疽芽胞杆菌感染具有致病力强、传染途径多、潜伏期短、发病快、病死率高等特点,对人类健康和社会稳定造成极大的威胁。因此,对炭疽芽胞杆菌的研究一直是生命科学领域的热点。

MLPA和多重PCR法检测假肥大性肌营养不良患者DMD基因突变

目的应用多重连接依赖式探针扩增(MLPA)法和多重PCR法对临床诊断为假肥大性肌营养不良患者进行基因诊断,并比较两种方法检测DMD基因缺失和重复改变的效果。方法选择2005年至2007年在中国医科大学盛京医院儿科就诊的51例DMD患者和8例BMD患者。采用MLPA法对经多重PCR法检测过的患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查,同时对先证者的母亲进行基因的缺失/重复突变检测。结果用多重PCR方法在59例假肥大性肌营养不良症患者中检测到31例患者有外显子缺失。MLPA检测出33例外显子缺失,6例外显子重复和1例点突变,同时检测出26例患儿的母亲为携带者。MLPA比多重PCR多检测出10例DMD基因突变,两种方法共同检测出的30例突变中MLPA检测出16例基因突变范围比多重PCR大。结论与多重PCR法相比,MLPA更加简便、快捷、可靠,同时可以对携带者进行诊断,是一种高效的遗传病基因诊断手段。

5例亲子鉴定常染色体STR突变基因座PI的计算与分析

短串联重复序列（short tandem repeats,STR）作为人类遗传学中一类重要的遗传标记,因其多态性高,个体识别能力强,扩增片段长度短,广泛地应用于法医学亲子鉴定、个体识别及遗传病连锁分析等方面[1]。STR核心序列的变异可能导致对结果分析的偏差甚至误判,因此引起法医分子生物学和遗传学工作者的重视[2],STR基因座在遗传过程中发生变异的机会相对较低,其突变率约在0.

普通小麦与山羊草叶绿体基因组长度热点突变区的核苷酸序列分析

检测了Ae.speltoides和Ae.ovata叶绿体基因组的一个长度热点突变区的核苷酸序列,并与普通小麦、四倍体Ae.crassa以及Ae.squarrosa的相应序列进行了比较分析。从rbcL基因的终止密码子到cemA基因内的HindIII位点,Ae.speltoides和Ae.ovata的核苷酸序列长度分别为2808和2810bp。与四倍体Ae.crassa的序列相比,在普通小麦和Ae.speltoides中各有一个791bp的大片段缺失,在Ae.ovata中存在一个793bp的大片段缺失。Ae.ovata的缺失片段比普通小麦和Ae.speltoides的长2个碱基,推测Ae.ovata的大片段缺失在进化上是独立发生的。Ae.speltoides的大片段缺失与普通小麦的完全相同,支持Ae.speltoides是普通小麦叶绿体基因组供体的假说。除了大片段缺失外,在这个区域还检测到了7个插入/缺失和15个碱基替换突变。研究结果表明,这个长度热点突变区的核苷酸序列分析是研究小麦与山羊草叶绿体基因组之间遗传变异关系的一个非常有效的途径。

RM07 DNA片段在嗜盐古生菌中的启动子功能研究

以二氢叶酸还原酶基因 (dhfr )和 β 半乳糖苷酶基因 (bgaH)为报告基因 ,利用启动子探针检测技术研究了在大肠杆菌和酵母菌中均具有启动子活性的RM0 7DNA片段在嗜盐古生菌中的功能 ,结果从mRNA转录和蛋白质表达水平证明RM0 7片段在嗜盐古生菌中同样具有启动子功能 .缺失分析进一步定位了RM 0 7片段中启动子活性必需的重要功能区 。

重离子辐射引起的线粒体DNA突变定量分析

目的对重离子辐射引起的线粒体DNA突变进行定量分析。方法使用X射线和重离子束对人乳腺癌细胞MCF-7进行辐照,对照后细胞进行克隆存活分析;用real-time PCR定量检测线粒体DNA4 977缺失,克隆测序法定量检测线粒体D310区突变。结果克隆存活结果和辐照后D310多态性分布显示重离子射线对MCF-7细胞的增殖抑制效果比X射线更为明显,引起的D310突变也更多,并且这些突变体能在辐照后的MCF-7细胞中稳定积累,但重离子辐照引起的线粒体DNA 4 977 bp缺失在细胞中仅能短暂存在。结论辐照后的细胞中存在着克隆选择机制,严重影响线粒体的正常功能突变体短暂存在于辐照后的MCF-7细胞,但很快被清除,如4 977大片段缺失;而D310突变随着细胞遗传,这表明它在线粒体中没有重要功能。

中国首个着色性干皮病变异型家系的POLH突变研究

目的检测一个着色性干皮病(xeroderma pigmentosum,XP)家系的基因突变。方法在2019年1—12月间,收集XP家系的临床资料和外周血标本,先证者采用新一代测序(next generation sequencing,NGS)进行测序,其余亲属采用Sanger测序验证。结果在一个中国家系中发现了POLH外显子9的无义突变(NM_006502.2,c.1066 C>T,p.Arg356Ter)和与XP相关的大片段缺失(外显子5-8)。结论中国XP家系,为XP的基因诊断和遗传咨询提供了重要信息。

中国人群中苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因大片段缺失突变分析

目的分析苯丙酮尿症（PKU）患者苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因大片段缺失突变的类型及分布情况。方法2006至2014年北京协和医院产前诊断中心和甘肃省医学遗传学中心共对953例PKU患者进行了PAH基因诊断，对其中43例经Sanger测序仍存在未知突变的PKU患者采用多重连接依赖式探针扩增技术（MLPA），进行PAH基因的外显子缺失或重复分析，并采用间隙PCR（Gap-PCR）及测序技术确定缺失突变的断点位置。结果43例PKU患者的47个未知突变等位基因中，22例患者检测到24个大片段缺失／重复突变等位基因，占突变性质不明等位基因的51．1％（24／47）。其中缺失突变6种，分别是Exldel3758突变（10个）、Ex4—5del突变（4个）、Ex4—7del突变（3个）、Exldel5329ins56突变（3个）、Ex3del6599ins8突变（2个）、Ex4del突变（1个）；重复突变1种，为Exl2dup（1个）。在这些缺失／重复突变中出现频率较高的为：ExldeB758（21．3％）、Ex4—5del（8．5％）、Ex47del（6．4％）。结论中国人群中存在PAH基因大片段缺失突变，具有明显的热点突变种类。

中国成年特殊类型糖尿病人群中肝细胞核因子1β基因大片段缺失、重复筛查

目的 了解上海及其周边地区汉族特殊类型糖尿病人群中肝细胞核因子1β（HNF-1β）基因大片段缺失、重复的发生情况.方法 选取2003年1月至2006年12月在上海市糖尿病研究所住院治疗的糖尿病患者104例,其中男74例,女30例,平均年龄（65±14）岁.患者酪氨酸磷酸酶样蛋白抗体和谷氨酸脱羧酶65抗体检测阴性,并且存在肾脏结构异常或肾功能受损.剔除其中3例存在HNF-1β基因点突变患者.其余101例患者应用多重链接探针扩增技术进行HNF-1β基因大片段缺失、重复筛查.结果 在1例多发肾囊肿伴右肾发育不全、双子宫、胰腺体尾部萎缩的患者中见到HNF-1β整个基因杂合性缺失.结论 HNF-1β基因大片段缺失在中国上海及其周边地区汉族特殊类型糖尿病人群中发生率较低,约占临床疑似HNF-1β基因突变糖尿病表现人群的1％,且大片段杂合性缺失患者的临床表现与点突变携带者相似.