SYBR GreenⅠ实时荧光定量多重PCR快速筛查葡萄球菌中常见大环内酯类耐药基因

目的评价SYBRGreenI实时荧光定量多重PCR结合熔解曲线分析快速筛查葡萄球菌常见大环内酯类耐药基因的可行性,利用此筛查方法了解深圳地区葡萄球菌中大环内酯类耐药基因的分布情况。方法选取经测序鉴定携带有大环内酯类耐药基因ermA,ermB,ermC,msrA的葡萄球菌,用一个包括这四种耐药基因引物的SYBRGreenI多重实时荧光定量PCR检测,经荧光定量曲线和熔解温度曲线(Tm值)确证和反应条件优化后建立针对大环内酯类常见耐药基因的初筛体系;随机选取临床136株葡萄球菌,利用此初筛体系对136株葡萄球菌是否携带常见大环内酯类耐药基因进行检测,并对检测结果和表型、电泳、测序结果进行比较,从而对此方法进行评价。对携带有大环内酯类耐药基因的细菌进行基因型别的鉴定,以了解大环内酯类耐药基因的分布情况。结果此SYBRGreenI实时荧光定量多重PCR初筛体系检测葡萄球菌常见大环内酯类耐药基因与表型检测比较达到94.8(129/136)的一致性,与琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果比较达到100的一致性。136株葡萄球菌检出msrA,ermA,ermB,ermC四种耐药基因,耐药基因总检出率为75.7(103/136),并发现多株携带多种大环内酯类耐药基因的葡萄球菌。结论SYBRGreenI实时荧光定量多重PCR可以快速准确地筛查葡萄球菌是否携带有常见的大环内酯类耐药基因;深圳地区葡萄球菌大环内酯类耐药率较高,主要耐药基因是ermC56.6(77/136),msrA24.2(33/136),ermA12.5(17/136)。

B群链球菌及其大环内酯类耐药基因LAMP快速可视化检测方法的建立和初步应用

目的建立一种快速可视化检测B群链球菌(GBS)及其大环内酯类耐药基因的环介导恒温扩增(LAMP)方法,为临床GBS检测提供新方法。方法针对GBS特异性基因cfb和大环内酯类耐药基因ermB、mefA/E和linB设计LAMP反应的引物;建立并优化LAMP的反应体系和反应条件,反应结果通过DNA扩增曲线和肉眼观察反应液颜色变化判断;以携带上述基因的质粒DNA为检测标准,确定LAMP方法检测目标基因的敏感性与特异性,并与PCR方法的检测结果比较;采用LAMP方法检测临床300份孕产妇阴道直肠拭子标本中GBS,与分离培养法的检出率进行统计学分析;采用LAMP方法检测80株GBS临床分离株中大环内酯类耐药基因,并与药敏试验结果进行统计学分析。结果建立了快速可视化检测GBS及其大环内酯类耐药基因的LAMP反应体系和方法,该法在63℃、45 min内完成;该法能够特异性检测pMD-cfb、pMD-ermB、pMD-mefA/E、pMD-linB质粒DNA,其灵敏度为10-5 ng/μL,是PCR方法灵敏度的100倍;对300份孕产妇阴道直肠拭子标本进行检测,LAMP方法对GBS检出率为12.7%,分离培养检出率为11.3%,两者没有统计学差异(P>0.05);药敏试验和LAMP方法检测80株GBS中大环内酯类耐药菌株的检出率分别为53.8%和48.8%,二者没有统计学差异(P>0.05)。结论本研究建立的GBS及其大环内酯类耐药基因LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视等优点,对临床新生儿GBS疾病的预防和治疗具有重要意义。