简州大耳羊CKMT2基因克隆、生物信息学分析及时空表达研究

【目的】克隆简州大耳羊肌节线粒体肌酸激酶2(creatine kinase mitochondrial 2,CKMT2)基因并探究其生物学特征,明确其在简州大耳羊不同组织以及不同分化阶段成肌细胞中的表达特性。【方法】采集简州大耳羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、臂三头肌组织样品,利用PCR方法扩增简州大耳羊CKMT2基因并克隆测序,通过在线软件对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术检测CKMT2基因在简州大耳羊不同组织及不同分化阶段成肌细胞中的表达水平。【结果】简州大耳羊CKMT2基因全长1 314 bp,其中包括CDS区1 259 bp,编码419个氨基酸,与绵羊和羚羊的亲缘关系最近。CKMT2蛋白是一种无信号肽及跨膜结构域的碱性亲水稳定蛋白,主要定位于线粒体、过氧化物类酶体及细胞质,共包含32个磷酸化位点、1个N-糖基化位点以及4个O-糖基化位点。蛋白二级结构主要包括α-螺旋(39.14%)、无规则卷曲(36.28%)、延伸链(16.23%)和β-转角(8.35%),三级结构与二级结构预测结果基本一致。蛋白互作分析结果显示,CKMT2蛋白与半胱氨酸和甘氨酸富含蛋白3(cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)、M型肌酸激酶(creatine kinase M-type, CKM)、磷酸甘油酸变位酶2(phosphoglycerate mutase 2,PGAM2)等蛋白存在相互作用。组织表达谱结果显示,CKMT2基因在简州大耳羊心脏中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05);在背最长肌中表达量较高,显著高于脾脏和臂三头肌(P<0.05)。时序表达谱结果显示,简州大耳羊CKMT2基因在成肌细胞诱导分化4 d时表达水平达到峰值,显著高于0、6 d(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆简州大耳羊CKMT2基因序列并明确了其分子特征,其在心脏、背最长肌以及成肌分化4 d时表达量较高。研究结果为进一步揭示CKMT2基因调控简州大耳羊成肌细胞增殖分化的分子机制奠定基础。

舍饲条件下简州大耳羊生产性能研究

简州大耳羊是四川省培育的肉用山羊品种之一,也是简阳市特色产业发展的基础,对推动我国肉用山羊的品种改良和肉羊产业发展发挥着重要的作用。试验以简州大耳羊为研究对象,在舍饲条件下开展体重、体尺、产羔率、断奶成活率等生产性能测定。结果表明:简州大耳羊早期生长发育较快,6月龄前平均日增重达130g/d;个体体型高大,成年公羊体长83.63cm、体高76.18cm、胸围88.64cm;繁殖性能较强,平均产羔率达219.01%。加强简州大耳羊在舍饲条件下繁育,研究及应用推广其高效育肥、饲养管理等技术,推动简州大耳羊改良其他品种及其产业发展。

一种中草药复方对低龄简州大耳羊血清免疫指标及肠道微生物多样性的影响

为研究一种中草药复方对低龄简州大耳羊免疫功能及肠道微生物多样性的影响,本试验将3、6月龄的简州大耳羊分为中草药组和对照组,中草药组添加不同剂量的中草药复方,对照组不添加,饲喂15 d后测定生产性能和血清免疫指标。结果显示:中草药组可提高3、6月龄简州大耳羊的平均日增重,并降低料重比;与对照组相比,中草药组可提高免疫球蛋白G(IgG)、碱性磷酸酶活力(AKP)、干扰素-γ(IFN-γ)及总超氧化物歧化酶活力(T-SOD)的含量;中草药组的Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数均有不同程度的提高;中草药组可提高拟杆菌等有益菌的定殖,且能减少厚壁菌、变形菌等致病菌数量。说明该中草药复方可提高3、6月龄简州大耳羊的免疫力,增加肠道微生物的多样性指数并改善肠道菌群结构。

发光二极管630nm红光和460nm蓝光照射对日本大耳白兔皮肤创面愈合的影响

目的观察发光二极管(LED)630 nm红光和460 nm蓝光照射对日本大耳白兔皮肤创面愈合的影响。方法采用日本大耳白兔8只,建立兔背部皮肤创伤模型,每只兔子3个伤口,分别给予红、蓝光距离15 cm垂直照射(15 min/次)和自然愈合处理。照射至创伤后第21天,观察各组创面愈合数目、愈合面积,计算创伤愈合面积百分比,比较两种光源的治疗作用;HE染色观察新生组织结构;Masson染色观察胶原纤维增生情况;免疫组织化学分析新生皮肤纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子(CD31)、增殖细胞核抗原(Ki-67)及炎性细胞因子(CD68)的表达情况。结果红光组、蓝光组和对照组的愈合率分别为50.0%(4/8)、25.0%(2/8)和12.5%(1/8)。自造模后第12天起,红光组伤口的愈合面积百分比均明显高于蓝光组及对照组(P<0.05或P<0.01)。建模后第21天,红光组新生皮肤厚度为(2.95±0.34)mm,明显高于对照组的(2.52±0.42)mm(F=3.182,P=0.016)。胶原纤维平均光密度为0.15±0.03,明显高于蓝光组的0.09±0.01(F=7.316,P=0.012)和对照组的0.07±0.01(F=7.316,P=0.003)。免疫组织化学检测结果显示,红光组的EGF、FGF、CD31抗原、Ki-67表达较蓝光组和对照组明显增多,CD68较蓝光组和对照组明显减少(P<0.05或P<0.01)。结论 LED红光照射可促进日本大耳白兔皮肤创面愈合,其可能是通过引起皮肤表皮细胞和血管内皮细胞生长及纤维组织增生来促成的。

WHBE兔与日本大耳白兔腹泻型肠易激综合征模型的肠道菌群研究

目的比较分析WHBE兔和日本大耳白(Japanese white rabbit,JW)兔腹泻型肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)模型肠道菌群的差异性。方法 WHBE兔和JW兔各16只,按品系随机分为两组,即正常对照(NC)组和IBS模型组,每组8只。采用湿热应激复合番泻叶方法建立腹泻型IBS兔模型,观察实验兔的腹围指数、粪便含水量、结肠转运功能,处死后分别取结肠组织和结肠内容物进行病理组织学观察和肠道菌群多样性分析。结果与NC组比,IBS模型兔均出现腹围指数和粪便含水量增加,结肠转运时间缩短,但结肠组织未见病理性改变;同时IBS模型兔Shannon指数和Chao1指数均显著下降(P<0.05)。根据OTU分类分析的结果,厚壁菌门和拟杆菌门为兔肠道菌群的绝对优势菌群。与NC组比较,WHBE兔IBS模型组厚壁菌门、疣微菌门、绿弯菌门、Akk菌属、链球菌属均明显下降(P<0.05,P<0.01),拟杆菌门和rc4-4菌属丰度显著上升(P<0.05,P<0.01);而JW兔IBS模型组优杆菌属和罕见小球菌属均显著上升(P<0.05),乳酸杆菌属、粪杆菌属、韦荣球菌属和链球菌属均显著下降(P<0.05)。与JW兔NC组比,WHBE兔NC组厚壁菌门、Odoribacter菌属、韦荣球菌属、链球菌属、颤螺旋菌属、Pseudoflavonifractor菌属较低(P<0.05,P<0.01),拟杆菌门、疣微菌门、优杆菌属、粪杆菌属、Akk菌属较高(P<0.05,P<0.01)。与JW兔IBS模型组比,WHBE兔IBS模型rc4-4菌属、粪杆菌属、梭菌属的丰度较高(P<0.05,P<0.01),而厚壁菌门、多尔氏菌属、粪球菌属和罕见小球菌属的丰度则较低(P<0.05,P<0.01)。结论 IBS模型兔存在肠道菌群失调,导致菌群多样性降低;WHBE兔和JW兔IBS模型肠道菌群变化均具有其自身的特点,且具有明显的差异性。

螺旋CT对日本大耳白兔气道的测量研究

目的探讨日本大耳白兔气管和主支气管各解剖径线的长度、角度及相关性,为进行气道疾病内支架介入治疗的动物实验研究奠定基础。方法用多层螺旋CT扫描30只成年健康日本大耳白兔的颈胸部,测量和测算气管各段前后径、左右径,声门水平到隆突的气管长度,左右主支气管和中间支气管内径与长度,以及左、右主支气管长轴与矢状面的夹角。结果气管各段直径、左右上肺尖叶支气管开口内径无差异,右主支气管长度、右主支气管长轴与矢状面夹角小于左侧,右主支气管内径大于左侧并有相关性。结论多层螺旋CT测定的日本大耳白兔气管、左和右主支气管径线值,获得左、右主支气管内径值、长度、嵴下角之间的回归方程,有助于为兔实验提供相关气管和支气管的解剖参数。

简阳大耳羊产肉性能及肉品质分析

该试验选取60只简阳大耳羊2月龄断奶公羔集中阉割后,分为放牧、放牧+补饲、舍饲3组进行饲养,分别在6月龄和周岁时进行屠宰产肉性能测定.结果显示在舍饲条件下,简阳大耳羊6月龄、周岁阉羊平均屠宰率为48.53%,50.03%,比放牧条件下高3.33个百分点和2.67个百分点,平均净肉率分别为37.06%,39.46%,比放牧条件下高2.16个百分点和1.67个百分点,表明简阳大耳羊是一个优良的肉用山羊品种,对简阳大耳羊进行舍饲,增加营养供给可提高产肉量.同时,对舍饲条件下简阳大耳羊6月龄羔羊肉进行了肉品质分析,结果表明简阳大耳羊羔羊肉肉质优良,胆固醇质量分数低,且富含人体所必须的各种氨基酸和脂肪酸,粗蛋白质量分数为21.08%,粗脂肪质量分数为1.22%,胆固醇质量分数为476.2μg/g;羊肉中必需的氨基酸质量分数比较丰富,占干物质的43.66%;羊肉脂肪酸中油酸质量分数为38.53%、亚油酸质量分数为4.42%、棕榈酸质量分数为18.71%.

微卫星技术在大耳白黑眼兔近交系培育中的监测分析

利用微卫星技术监测大耳白黑眼兔(white hair black eyes rabbits,WHBE兔)近交培育中第五代(F5)、第六代(F6)和第七代(F7)的遗传多样性。选取21个微卫星座位,筛选出扩增产物稳定并且具有多态性的11对微卫星引物用于本研究。结果表明,F5代WHBE兔在每个座位上的等位基因数(Na)为3～9个不等,11个座位的平均有效等位基因数(Ne)为1.81个,平均观察杂合度(Ho)和平均多态信息含量(PIC)分别为0.381和0.524,累积个体识别率(CDP)达到100%,累积非父排除概率(CPE)在双亲信息都是未知情况下的为0.926,而在得知任一亲本信息的情况下,CPE值为0.993。F6代WHBE兔在每个座位上的Na为3～8个不等,11个座位的平均Ne为1.68个,平均Ho和PIC值分别为0.356和0.548,CDP达到100%,CPE在双亲信息都是未知情况下的为0.931,而在得知任一亲本信息的情况下,CPE值为0.994。F7代WHBE兔在每个座位上的Na为2～6个不等,11个座位的Ne为1.51个,平均Ho和PIC值分别为0.287和0.498,CDP达到100%,CPE在双亲信息都是未知情况下的为0.891,而在得知任一亲本信息的情况下,CPE值为0.986。在近交系培育过程中,从F5代到F7代,WHBE兔的平均Ne和平均Ho都呈下降趋势,提示随着近交代数的增加,WHBE兔的基因纯合度越来越高。

螺旋CT测量日本大耳白兔气道径线的窗宽窗位选择

目的探讨日本大耳白兔气管和主支气管解剖径线CT测量的窗位与窗宽选择,为气道支架动物实验奠定基础。方法多层螺旋CT扫描30只成年健康日本大耳白兔的胸部,分别常规肺窗、纵隔窗和特殊的脂肪窗测量气管胸段前后径、左右径、左右主支气管前后径。比较不同窗宽窗位下气管壁显示以及测量数据与解剖数据之间的差异。结果肺窗气管壁均清晰显示,但测量的结果偏小;纵隔窗气管壁显示模糊,测量的结果偏大;而脂肪窗气管壁显示均匀,测量的数据比较接近实际气管直径的解剖参数。结论多层螺旋CT测定日本大耳白兔气管左右径和前后径应选择脂肪窗为佳。有助于为人相关气管和支气管定制气道支架确定最佳的窗宽和窗位。

简阳大耳羊黑色类群成年母羊体重与体尺指数回归分析

采用SPSS软件对256只简阳大耳羊黑色类群成年母羊进行主要体尺与体重间相关性分析、通径分析和回归分析,并用分析结果推测了简阳大耳羊黑色类群主要体尺对体重的影响程度,建立了两个体尺与体重间的回归模型:y=-30.765+0.952x3,y=-59.385+0.830x3+0.515x2,并对此公式进行了F检验。结果表明:各主要体尺性状在不同程度上影响着简阳大耳羊黑色类群成年母羊的体重,其中胸围、体长达到了极显著相关程度(r1=0.682,r2=0.733,P<0.01),得出的公式预测值与实际测定值无明显差异。因此,在简阳大耳羊黑色品系选育和生产研究中,应结合传统选育方法和新方法,以胸围为主要选育指标,兼顾体长,可减少资源浪费,缩短世代间隔,取得较好的效果。

日本大耳白兔、新西兰兔血液蛋白多态性的研究

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法对日本大耳白兔、新西兰兔血液中的血清转铁蛋白 (Tf)、前转铁蛋白 (Prt)、后白蛋白 (Po)、血液结合素 (Hp)、红细胞酯酶 (ES - 1、ES - 2和ES - 3)等 7个蛋白座位进行测定。结果表明 :这 7个座位均呈多态。在多态座位中 ,Tf、Prt、Po、Hp、ES - 1、ES - 2、ES - 3分别出现 3、3、6、3、3和 3种表型 ,受 2、2、3、2、2和 2个共显性等位基因控制。X2 检验表明 ,新西兰兔在这 7个座位上均处于平衡状态 (P >0 .0 5 ) ,日本大耳白兔在Tf、Po、ES -1、ES - 34个座位处于平衡 (P >0 .0 5 ) ,而在Prt、Hp、ES - 2出现不平衡状态 (P <0 .0 5 )。

简阳大耳羊不同泌乳期乳成分含量动态变化

为了研究山羊不同泌乳阶段乳成分动态变化规律,试验随机选取不同泌乳阶段的简阳大耳羊泌乳母羊,采集乳样测定乳成分和乳中氨基酸含量。结果表明:(1)初乳(1 d)中非脂固体物、乳蛋白、乳脂肪、乳糖、灰分、钙、磷含量以及pH值分别为20.30%、7.52%、9.10%,11.93%、0.88%、0.35%、0.14%和6.57;常乳中非脂固体物、乳蛋白、乳脂肪、乳糖、灰分、钙、磷含量以及pH值分别为9.01%、3.17%、6.91%、5.05%、0.76%、0.16%、0.11%和6.60。(2)初乳中氨基酸含量较高的是谷氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸,含量较低的是缬氨酸、蛋氨酸和甘氨酸;常乳中氨基酸含量较高的是谷氨酸、脯氨酸和赖氨酸,含量较低的是缬氨酸、丙氨酸和胱氨酸。

Vc-獭兔、日本大耳白兔与新西兰白兔血液蛋白多态性研究

为给加速 Vc-獭兔育种提供理论依据 ,利用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对 Vc- 系、 系獭兔、日本大耳白兔和新西兰白兔血液中的红细胞酯酶 (Es-1、Es-2和 Es-3 )、血清前转铁蛋白 (Prt)、后白蛋白 (Po)等 5个蛋白位点的多态性进行了测定 ,结果表明 :在 4个群体中 ,Es-1、Es-2、Es-3和 Po各有 3种表型 ,分别受 2个共显性等位基因控制 ,Prt有 6种表型 ,受 3个共显性等位基因控制。计算表型频率及基因频率。并根据基因频率计算遗传距离和聚类分析 ,分析结果 :Vc- 系、Vc- 系獭兔的亲缘关系最近 ;Vc-獭兔与日本大耳白兔的亲缘关系较近 ,与新西兰白兔的亲缘关系较远 ,日本大耳白与新西兰白兔的亲缘关系最远。

简州大耳羊产肉性能世代选育进展及肉品质研究

应用简州（阳）大耳羊培育过程中的基础数据,分析研究了其在培育过程中的产肉性能和新品种肉质品质.结果显示：四世代成年公羊、周岁阉羊、成年母羊的宰前活重分别达73.12 kg±0.98kg、45.55 kg±0.93 kg、50.62 kg±0.53 kg,分别比一世代增加了2.63、2.72和2.56 kg.产肉性能指标在培育过程中稳定增长,世代进展明显,二、三、四世代产肉性能均较上一世代有明显提高.肉品质方面,简州（阳）大耳羊6月龄羔羊肉pH值6.59,熟肉率59.87％～61.87％,滴水损失2.01％～2.72％,干物质中必需氨基酸含量43.66％,粗蛋白含量21.08％,粗脂肪含量1.22％,胆固醇含量47.62 mg/100 g;脂肪酸中油酸含量38.53％、亚油酸含量4.42％、棕榈酸含量18.71％.表明简州（阳）大耳羊羔羊肉肉质优良,胆固醇含量低,富含人体所必需的各种氨基酸和脂肪酸,是高档肉类产品.

微卫星标记对WHBE兔封闭群、日本大耳白兔和新西兰兔的遗传分析

目的分析比较大耳白黑眼兔（WHBE兔）封闭群与日本大耳白兔（Jw兔）、新西兰兔（NZW兔）基因组存在的微卫星结构，研究WHBE兔封闭群的微卫星多态性。方法利用21个微卫星位点，通过微卫星分子标记技术对WHBE兔封闭群、Jw兔和NZW兔进行遗传多样性检测和对比。结果根据初步结果，在21对微卫星引物中筛选出扩增产物稳定并且具有多态性的11对引物。WHBE兔封闭群在每个位点上的等位基因数为3～8个不等，11个位点的平均有效等位基因数为2．0402个，平均杂合度为0．4810；Jw兔在每个位点上的等位基因数为2～8个不等，11个位点的平均有效等位基因数为3．6077个，平均杂合度为0．5039；NZW兔在每个位点上的等位基因数为3～9个不等，11个位点的平均有效等位基因数为2．6537个，平均杂合度为0．5334。WHBE兔封闭群在11个微卫星位点上的平均多态信息含量（PIC）为0．6005，多位点累积个体识别率达到100％，多位点累积非父排除概率（CPE）在双亲信息都是未知情况下的为0．9613，而在得知任一亲本信息的情况下，CPE值高达0．9973。在11个微卫星座位中，9个位点上出现了WHBE兔封闭群特有等位基因，其中在Sat2、Sat5、Sat7、Sat12、Sat13、Sat16、S0144和INRACCDDV0003八个位点上WHBE兔封闭群的特有等位基因为一个，在sat8位点上为两个。结论WHBE兔8个位点的平均杂合度、平均有效等位基因数均比JW兔及NZW兔低，说明WHBE兔群体的基因纯合度高于其他两个品系，具有更优的遗传稳定性。9个WHBE兔特有的等位基因可作为区分WHBE兔封闭群和其它两个品系实验兔的分子标记。

日本大耳白兔、新西兰白兔的遗传分化研究

应用平均基因杂合度、平均基因纯合度、等位基因有效数、基因均质度、Lewontin的Shannon信息测度 ,对日本大耳白兔、新西兰免两个群体存在的血液蛋白位点的基因频率进行遗传分析 ,研究表明 :日本大耳白兔的基因杂合度、等位基因有效数指标和Shannon信息测度值均高于新西兰白兔 。

湖北封闭群日本大耳白兔部分生物学参数的观察

目的 建立湖北封闭群日本大耳白兔生物学数据库 ,为毒理学实验提供相关的实验动物背景资料。方法 采用物理称重法测定日本大耳白兔体重、脏器重量 ;自动血球计数仪、半自动生化分析仪测定红细胞数等 10项血液有形成分和血红蛋白 ,以及碱性磷酸酶等 10项生化参数。并与国内常用新西兰和北京的大耳白实验兔有关参数进行对比。结果 提供了湖北封闭群日本大耳白兔的体重、脏器重量 ;RBC ,HGB ,MCV ,MCH ,MCHC ,HCT ,PLT ,MPV ,WBC ,W SCRW LCR ,和AST、ALT、ALP、BUN、TP、ALB、GLU、T -BIL、Grea、T -CHO等与安全性评价有关常用参数。结论 不同品种间的动物生物学特性有差异 ,即使同一品种而地区不同的封闭群动物 ,由于环境、饲养方式、营养状态不同 ,某些生物学特性和血液、生化参数也有差别。因此 ,为毒理学实验者提供实验家兔时 ,除提供微生物等级合格证外 ,还应按实验需求提供有关的生物学参数。

陕西省某羊场简阳大耳山羊球虫感染情况调查及种类鉴定

为了解陕西省某简阳大耳山羊场球虫种类和感染情况,采集不同年龄段简阳大耳山羊新鲜粪便55份,用形态学方法并结合麦克马斯特虫卵计数法（McMaster＇s method）对该场简阳大耳山羊球虫进行种类鉴定和感染情况调查。结果表明,大耳山羊球虫总感染率为92.7%,其中3月龄~7月龄、10月龄~12月龄、3岁山羊球虫检出率分别为100%、90%和86.7%,各年龄段平均OPG值为3 300、1 050、854。共鉴定出8种山羊球虫,其中阿氏艾美耳球虫（Eimeria arloingi）、雅氏艾美耳球虫（E.ninakohlyakimovae）和艾氏艾美耳球虫（E.alijevi）为该羊场优势虫种。

简阳大耳山羊粪尿养分测定

分析简阳大耳山羊不同年龄性别组粪尿养分含量的变化,为降低粪尿排放造成的污染和调配科学高效的饲料配方提供依据.试验山羊按年龄、性别分为A,B,C和D四个组,采用ICP-OES 6300 Radial测定有机质、全氮、全钾,并参照NY525-2002《有机化肥》评价分析.结果显示,1岁组山羊粪有机质、全氮、全钾含量均高于3岁组,公山羊组中全氮、全钾含量高于母山羊组.结论,简阳大耳山羊不同年龄、性别粪、尿中养分含量有较大差异.建议根据国家《畜禽养殖业污染物排放标准》(GB 18596-2001)和国家《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)和NY/T816—2004肉羊饲料标准拟定适合不同年龄性别山羊的饲料配比.

简州大耳羊体重体尺世代选育进展及生长发育规律研究

为探索简州大耳羊的生长发育规律,对简州大耳羊核心群世代选育体重、体尺数据资料进行了分析。结果表明:通过世代选育,简州大耳羊各世代核心群均有所提高,但各世代间增量不同。选育进入第三世代后,体重、体尺指标趋于稳定。同时,抽样测定了简州大耳羊品种群2745只羊的生长性能。结果表明:简州大耳羊个体大、生长发育快,在舍饲条件下,公羊2月龄(断奶)平均体重14.25 kg,母羊12.43 kg;公羊6月龄平均体重29.37 kg,母羊23.14 kg;公羊周岁平均体重47.19 kg,母羊34.67kg;公羊成年平均体重69.68kg,母羊47.26kg。简州大耳羊初生到周岁公、母羊平均日增重分别为120.91 g和86.96 g。简州大耳羊生长发育曲线表明,从断奶至8月龄的体重呈直线上升趋势,从8月龄开始生长发育速度减缓,说明简州大耳羊具有早期生长发育快的基本特征。