大肠埃希菌热敏性肠毒素B亚基研究进展

产肠毒素大肠埃希菌(EnterotoxigenicE.coil,ETEC)是引起幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原之一。ETEC产生两类肠毒素,一种是对热敏感的热敏性肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT),另一种是对热不敏感的耐热性肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)。LT不仅是ETEC主要的毒力因子,而且还是一种重要的黏膜佐剂,它由A、B亚基组成,由于LT A具有毒性作用,限制了LT作为黏膜免疫佐剂的应用;而LT B无毒且具有黏膜佐剂活性,使其成为备受关注的佐剂之一。近年来对LT B的结构、介导的免疫调节分子机制、突变体及其佐剂作用已进行了较为深入的研究,为充分利用LT B的黏膜免疫佐剂功能奠定了基础。

大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基(heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并制备其多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增LTB基因,并将其连接至pET30a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pET30a(+)-LTB-8×His,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对目的蛋白表达条件进行优化。利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,免疫大耳白家兔制备兔源抗LTB多克隆抗体。结果重组原核表达质粒pET30a(+)-LTB-8×His经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组LTB蛋白相对分子质量约为13000,以包涵体形式表达,最佳诱导条件为:用0.4 mmol/L IPTG于30℃诱导4 h;纯化后蛋白浓度为3.7 mg/m L;制备的多克隆抗体可用于LTB的Western blot及IFA检测。结论利用大肠埃希菌表达系统成功表达了重组LTB蛋白,并制备了具有良好反应原性和特异性的多克隆抗体,为产肠毒素型大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)疾病的诊断及LTB黏膜免疫佐剂特性的研究奠定了基础。

空肠弯曲菌peb1A与大肠埃希菌ltB基因融合基因的构建、表达及鉴定

目的采用重叠PCR方法将大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位ltB基因和空肠弯曲菌外膜蛋白peb1A基因进行连接,构建ltB-peb1A融合基因原核表达系统,对其进行诱导表达与鉴定。方法利用PCR技术扩增ltB与peb1A基因,用重叠PCR法将ltB与peb1A基因进行融合,然后插入pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET28a(+)-LtB-peb1A。用重组体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白LTB-PEB1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,ELISA法鉴定其与牛Gm1活性,Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果 PCR及测序证实ltB-peb1A融合基因原核表达载体pET28a(+)-LtB-peb1A构建成功,SDS-PAGE分析目的蛋白最高表达量占全菌总蛋白的28%左右,其分子质量单位为40.7ku。ELISA法鉴定纯化的重组蛋白与牛Gm1有结合活性,Western blot分析重组蛋白能被兔抗空肠弯曲菌识别。结论成功构建了ltB-peb1A融合基因原核表达载体,并获得高效表达的目的蛋白,为空肠弯曲菌黏膜免疫疫苗的研制奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位作为黏膜免疫佐剂的研究

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的组成部分之一,具有免疫原性,但无毒性,是一种较为理想的黏膜免疫佐剂。本文就大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分子结构、介导的免疫反应及其黏膜免疫佐剂效应作一综述。

EHEC O157:H7紧密黏附素C300与LTB融合基因克隆与序列分析

目的构建肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157：H7紧密黏附素C-端免疫保护片段与肠黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）的融合基因克隆载体,为进一步研究EHEC O157：H7重组疫苗奠定了基础.方法设计引物采用PCR技术从EHEC O157：H7基因组中扩增Intimin C300的编码基因,从肠产毒性大肠埃希菌基因组中扩增LTB的编码基因,分别构建克隆载体pUC18-C300和pUC18-LTB,采用酶切位点相连技术,构建pUC19-C300-LTB克隆载体,并测序.结果从EHEC O157：H7基因组中扩增出了900 bp的目的片段,从肠产毒素大肠埃希菌基因组扩增出了275 bp的目的片段,分别插入载体pUC18和pUC19,经酶切及测序鉴定与目的序列一致.结论克隆出EHEC O157：H7的紧密黏附素C-端免疫保护片段与不耐热肠毒素B亚单位基因,并成功构建融合基因克隆载体,测序正确.