舍饲条件下藏仔猪腹泻源大肠杆菌毒力和粘附因子基因检测与耐药性分析

为有效预防和治疗藏仔猪腹泻,采用PCR和Kirby-Bauer纸片扩散法对西藏林芝市舍饲藏仔猪分离的102株腹泻源大肠杆菌(Escherichia coli)毒力基因、粘附因子基因和耐药性进行检测。大肠杆菌毒力基因和菌毛粘附因子基因检测结果表明,检出率最高的菌毛粘附因子基因是F18(45.10%),其次是F4(15.69%),所有菌株均未检出F41基因;102株菌株中有37株菌株未检出菌毛粘附因子基因。毒力基因中检出率最高的是Stx2e基因(25.49%),其次为STb:EAST-1基因(21.57%)和STa:STb基因(17.65%)。大肠杆菌菌毛粘附因子基因和非菌毛粘附因子基因检测结果表明,在检出AIDA-1基因的菌株中菌毛粘附因子基因(F18、F4)的菌株占比为44.73%,在检出paa基因的菌株中菌毛粘附因子基因(F18、F4)的菌株占比为54.17%;在检出eae基因的菌株中没有检测到F4基因。大肠杆菌对氯霉素、四环素、氨苄西林和链霉素表现出高的耐药性,对3种及以上抗生素产生耐药性的大肠杆菌菌株数占总菌株数的86.27%。

大肠杆菌E.coli HB101(pBR322)高密度培养过程质粒的稳定性

通过正交实验考察了大肠杆菌E.coli HB101-pBR322)高密度培养过程中，不同培养条件对质粒的稳定性和β(内酰胺酶活力的影响. 结果表明，当温度在33(39oC、pH为6.4-7.2、DO为 40%-80%、 补料速率在5.4-10.8 g/h范围内变化，以及细胞密度达到27.3 g/L、比生长速率达到0.73 h-1时，质粒没有发生丢失现象，但在培养过程中β-内酰胺酶的活力降低.

伴大豆球蛋白水解肽对灌喂大肠杆菌(E.coli)的小鼠肠道微生物区系和健康的影响

目的研究服用伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽的小鼠,灌喂E.coli后的健康状况,分析小鼠灌喂E.coli后24h,48h粪样微生物区系的变化。方法应用PCR-DGGE技术对小鼠粪样微生物区系进行相似性分析;应用连续稀释PCR的方法检测小鼠灌喂E.coli后24h,48h粪样中细菌的数量;同时观察小鼠灌喂E.coli后的健康状况。结果小鼠灌喂E.coli后24h,盐酸彻底水解伴大豆球蛋白液组(HCL-FHC)和灌菌对照组(CON)的相似性较高(71.5%),伴大豆球蛋白组(Conglycinin)和伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽组(PTC)与正常对照组(CONN)的相似性都较高(分别为82.4%和72.9%);灌喂E.coli后48h,CONN组和CON组的相似性不高(59.6%),PTC组和CONN组的相似性较高(73.7%),PTC组和Conglycinin组、HCL-FHC组、CON组的相似性都不高(分别为51.4%、56.3%、48.1%),PTC组小鼠粪中细菌的数量明显低于CON组和HCL-FHC组,同时PTC组健康小鼠的数量明显多于其它处理组。结论伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽能维持肠道健康的微生物区系,降低肠道细菌的数量,维持感染E.coli后小鼠的健康。

嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus 1622)和重组大肠杆菌(E．coli(pGM-PA))乙醇发酵特性研究

通过对嗜鞣管囊酵母和重组大肠杆菌代谢木糖及混合糖产乙醇研究,阐明两种菌的不同发酵能力。结果表明:重组大肠杆菌在5%木糖培养基中乙醇产率为理论值的100%,在10%木糖的培养基中乙醇产率达到理论值的96%。重组大肠杆菌木糖转化乙醇的能力明显高于嗜鞣管囊酵母,但嗜鞣管囊酵母与重组大肠杆菌相比乙醇耐受度更高(可达8%).且代谢过程中pH降低幅度不大。固定化技术对于提高P.tannophilus 1622乙醇发酵表现作用显著,而对重组大肠杆菌乙醇发酵的产率提高没有明显作用。

利用小泛素蛋白修饰分子融合技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组抗菌肽LLv

为了研究在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中利用小分子泛素蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)融合技术表达重组抗菌肽LLv(antimicrobial peptide LLv)的方法。试验以天然抗菌肽LL-37氨基酸组成及分子结构为依据,人工设计了LLv的氨基酸序列和基因序列。利用SUMO融合技术,构建重组大肠杆菌表达载体pSUMO-LLv在E.coli BL21(DE3)中表达SUMO-LLv,并研究异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-thiogalacyranoside,IPTG)浓度和诱导时间对融合蛋白SUMO-LLv表达的影响,同时分析融合蛋白SUMO-LLv表达的可溶性并分离纯化目的蛋白LLv。结果表明:建立的E.coli BL21(DE3)的pSUMO-LLv重组表达载体,经DNA测序验证构建正确;SUMO-LLv的诱导表达最佳条件是IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导表达时间为2 h;融合蛋白SUMO-LLv主要存在于菌液上清液中,表达含量为11.34μg/mL;免疫印迹试验(Western blot)鉴定证明融合蛋白具有良好的反应原性;采用Ni柱亲和层析法在诱导菌液中成功纯化到了目的蛋白LLv,大小为5 kDa。说明在E.coli BL21(DE3)中利用SUMO融合技术表达重组抗菌肽LLv的方法可行。

利用噬菌体T＿7RNA聚合酶在大肠杆菌（E．coli）中引导人尿激酶原克隆基因的表达

我们将人尿激酶原基因（ｐｒｏ－ＵＫ）重组到含Ｔ＿７基因１０启动子的质粒（ｐＥＴ３ｃ）中，用异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中进行表达。经纤维蛋白平板测活法测得表达产物存在于包含体中。经变性和复性处理后，表达量达每升培养液１６００ＩＵ．用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法鉴定表达产物为单一条带。分子量在４３ｋＤａ左右，略低于天然５４ｋＤａｐｒｏ－ＵＫ。这可能与Ｅ．ｃｏｌｉ中缺乏糖基化酶有关。

FDA在保证食品安全中的作用和跟踪、解决近期菠菜中大肠杆菌E.coli O157:H7爆发的措施

美国食品药物管理局食品安全和应用营养中心主任、博士罗伯特E．布莱克先生在美国参议院卫生、教育、劳工、退休基金委员会上的演讲。

中国对虾素在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达

中国对虾素是从中国对虾血细胞中克隆得到的一种抗菌肽。为了进一步研究中国对虾素(CHP)的功能并为制备特异性抗体作准备,采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,进行了对虾素原核表达的研究。根据从中国对虾血细胞中克隆得到的对虾素基因设计特异性引物扩增中国对虾素成熟肽基因(Chp),插入原核表达载体pGEX4T1中,在E.coliBL21表达融合蛋白GSTCHP。结果表明,不同表达菌株的融合蛋白表达量为30%—34%,同一菌株在诱导5h后能达到最高表达量。利用GST亲和层析纯化融合蛋白,将融合蛋白用凝血酶裂解以得到CHP,其分子量约为5.6kDa,N端测序结果与期望的成熟对虾肽序列一致。用液体生长抑制方法检测活性,表明重组GSTCHP蛋白及CHP均表现出对大肠杆菌的抑菌活性。

猪源大肠杆菌(ETEC、STEC、AEEC)毒力基因及其与O抗原型的关系

【目的】揭示从我国部分地区仔猪腹泻或水肿病病猪体内分离到的300个大肠杆菌分离株所属病原型(pathotype)、毒力基因及其与O血清型的关系。【方法】O血清型采用常规的凝集试验进行测定,毒力基因采用PCR方法检测。【结果】通过对这300个分离株的O血清型及其毒素、紧密素和黏附素基因进行鉴定,结果显示除50株未定型、17株自凝外,测定出233个分离株的血清型,这些分离株覆盖了45个血清型,其中以O149、O107、O139、O93和O91为主,共133株,占定型菌株的57.1%;拥有estⅠ、estⅡ、elt、stx2e和eaeA基因的菌株分别为102(34.0%)、190(63.3%)、81(27.0%)、57(19.0%)和54(18.0%)株;分离株中有51株K88基因阳性(其中菌毛表达率为100%),75株F18基因阳性(其中菌毛表达率为50.7%),在K88菌株中,O149血清型与estⅠ或estⅡ+elt密切相关,在F18菌株中,O107血清型与estⅠ或estⅡ、O139血清型与stx2e紧密相关。依其毒力特征可将这些分离株分为以下6种类型:ETEC、STEC、AEEC、ETEC/STEC、AEEC/ETEC和AEEC/ETEC/STEC,分别拥有190、24、36、32、17和1个菌株,占分离株的63.3%、8.0%、12.0%、10.7%、5.7%和0.3%。通过分析这些分离株的O血清型、毒素类型和黏附素型之间的相关性:猪源ETEC以O149、O107、O93和O98等血清型为主,O149:K88菌株主要与estⅡ或estⅡ+elt肠毒素相关,O107:F18菌株主要与estⅡ相关,O93和O98血清型菌株主要与estⅡ肠毒素相关;STEC菌株以O139:F18血清型为主,拥有stx2e;AEEC菌株拥有紧密素,无明显优势血清型;ETEC/STEC菌株以O107:F18和O116:F18血清型为主,主要与estⅠ+stx2e或estⅡ+stx2e密切相关,ETEC/AEEC菌株以O91和O107血清型为主,全部拥有肠毒素estⅠ和紧密素基因。【结论】我国至少存在6种病原型的猪肠道致病性大肠杆菌,其中ETEC为我国部分地区猪大肠杆菌病的主要病原,同时其病原型日益复杂。

乙脑病毒E蛋白中和表位与结核杆菌hsp70在大肠杆菌中的融合表达

根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则,人工合成了乙脑病毒E蛋白C末端的中和表位,位于E蛋白上373-399 aa,通过EcoRⅠ和HindⅢ连接构建原核表达载体pET-32a-epitope。将hsp70通过HindⅢ和XhoⅠ连接到载体pET-32a-epitope上中和表位的3′端,构建融合表达载体pet-32a-epitope-hsp70。诱导表达后,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE,结果表明该融合蛋白以包含体形式存在。将包含体在8 mol/L的尿素中过夜溶解,然后将上清过柱,获得良好的纯化结果。融合蛋白的分子量为94 kD。Western blot显示该蛋白兼具对JEV和结核杆菌热休克蛋白70（M.Thsp70）的特异抗原性。

大肠杆菌菌影制备及介导pEGFP-N1在RAW264.7细胞中表达

通过PCR扩增噬菌体PhiX174裂解基因E,并将其插入到温控表达载体pBV220中,构建重组温控表达质粒pBV220-E。将重组质粒pBV220-E转化至大肠杆菌DH5α中,升温到42℃诱导E基因的表达。将真核表达质粒pEGFP-N1与大肠杆菌菌影孵育后转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,荧光显微镜观察pEGFP-N1的表达情况。结果表明:扩增的E基因全长为276bp,与GenBank公布的基因序列一致。电镜观察结果显示,细菌表面出现跨膜孔道,细菌内容物经孔道排出形成空壳。荧光显微镜观察结果显示,大肠杆菌菌影介导的pEGFP-N1在小鼠巨噬细胞中获得表达。为进一步研究以细菌菌影为基础的新型灭活疫苗和载体疫苗提供参考依据。

利用PCR法鉴定产SLT-IIe大肠杆菌

类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体（ Ｓｈｉｇａｌｉｋｅ Ｔｏｘｉｎ Ⅱ Ｖａｒｉａｎｔ， Ｓ Ｌ ＴⅡｖ ｏｒ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ），是仔猪水肿病的主要致病因子。根据 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 基因序列，合成一对针对 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 操纵子基因保守区的寡核苷酸引物，建立了聚合酶链式反应（ Ｐ Ｃ Ｒ）扩增方法。通过对产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 毒素大肠杆菌菌株 Ｔ Ｂ１、产 Ｓ Ｌ ＴⅡ毒素大肠杆菌菌株 ９３３ Ｗ 和产 Ｓ Ｌ ＴⅠ毒素大肠杆菌菌株 Ｈ３０ 的试验，结果表明用所设计的引物建立的 Ｐ Ｃ Ｒ方法可特异性鉴定产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 大肠杆菌。用此法对本实验室从患水肿病仔猪肠道分离的 １５ 株大肠杆菌进行了鉴定，结果可从 １５ 个菌株的 １２ 株中扩增到 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 的特异性保守序列基因片段，而其它菌株未见此保守序列的基因片段。

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。

大肠杆菌F18菌毛E亚单位基因克隆与序列分析

根据已发表的F18ab菌毛E亚单位的基因序列(fedE/ab),设计1对引物,利用PCR技术从10株大肠杆菌(F107/86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到1个片段,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒TF107E、TYCED1E、TYCED2E、TCE、TDE、TEE、T12FE、T8813E、T8199E、T2134PE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,这10个片段大小均为516 bp。通过与已发表的fedE/ab序列进行比较,发现这10个菌株的fedE序列高度同源,其中F107/86、YCED2、C、D、E、8813、8199、2134P的fedE序列完全相同,只有YCED1株在第45位碱基处存在1个G→A转换、12F株在第316位碱基处存在1个G→转换。这说明F18ab和F18ac菌毛的fedE基因相同,fedE是F18菌毛的保守性亚单位。

贵州部分地区猪源大肠杆菌耐药性分析及ESBLs基因型检测

为了解贵州地区规模养猪场大肠杆菌菌株耐药情况和ESBLs基因型的流行情况,试验采用CLSI推荐的方法对采自贵州省4个地区规模养猪场的164株大肠杆菌进行药物敏感性试验和产ESBLs菌的检测,并用PCR方法对TEM、SHV、OXA-1和CTX-M-1 4种常见ESBLs基因进行检测。结果显示,164株大肠杆菌对10种常用抗菌药物耐药率分别是头孢噻呋93.29%、氨苄西林87.19%、四环素86.59%、庆大霉素81.10%、链霉素53.66%、多黏菌素51.83%、环丙沙星53.05%、卡那霉素47.56%、金霉素34.76%和氟苯尼考21.95%,且大多为多重耐药,其中检测出ESBLs阳性菌株137株,阳性率为83.54%,各个地区的检出率不同;137株产ESBLs大肠杆菌中,TEM、SHV、OXA-1和CTX-M-1基因的检出率分别为90.51%、70.07%、51.82%和43.07%,且多为复合基因型耐药菌株,各地区的各种基因检出率不同。试验结果表明,贵州部分地区的猪源大肠杆菌耐药现象严重,ESBLs菌株的检出率很高,耐药基因的检出率也极高,且多为复合基因型耐药菌株,应加强当地产酶耐药菌的监测和研究,有效防制此类细菌引发的疾病。

重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化

研究自行构建的产β-葡聚糖酶的工程菌E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl在LB培养基中的生长特性,考察种子液的菌龄、培养基起始pH、接种量及诱导起始时发酵液菌浓度等对β-葡聚糖酶产生水平的影响;通过正交试验确定诱导剂IPTG及乳糖添加量、诱导温度及诱导剂作用时间。结果表明:培养基起始pH7.0,对数生长中期的种子液(OD600为0.35)以接种量(体积分数)10%接入摇瓶发酵培养,37℃,200 r/min培养约3 h,菌液OD值达到1.0左右,添加终浓度分别为0.033 6 mmol/L的IPTG及10 mmol/L乳糖,24℃诱导6 h,发酵液清液中酶活达到最高(336.33 U/mL),菌体生长量为1.12 g/L,发酵液中总酶活达到459.32 U/mL,是原始菌株在相同条件下所产酶活的6.62倍。采用优化培养条件及诱导剂作用条件,重组菌在TB培养基中酶活水平进一步提高,诱导剂作用10 h,发酵清液中酶活为1 090.31 U/mL,总酶活1 570.83 U/mL,是原始菌在该条件下酶活的19.73倍,显示出重组菌具有广阔的工业化应用前景。

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定及在大肠杆菌中的表达

【目的】鉴定来源于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因;研究其在大肠杆菌系统的克隆与表达;分析该酶与其同源酶的活性中心氨基酸序列。【方法】从本实验室筛选的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus;CCTCC M203062)发酵液中,分离纯化得到谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-MTGase),测得N-端前十个氨基酸序列并与其它链霉菌来源的相应基因序列比较设计引物,扩增得到pro-MTGase基因,将该基因插入到表达载体pET-20b(+)信号肽pelB下游,构建分泌型表达载体pET/pro-MTG,并转化不同的大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS。【结果】获得了pro-MTGase的完整基因序列,多重碱基序列比对表明其与S.platensis和S.caniferus的pro-MTGase基因同源性高达92%。利用Rosetta(DE3)pLysS通过降温至24℃诱导策略,获得部分胞外表达的酶原。SDS-PAGE显示,胞外表达重组蛋白的分子量约为44kDa,与吸水链霉菌表达的天然酶原相符。诱导4h后发酵液中的重组酶原经胰蛋白酶活化为成熟酶后测得最高酶活为0.24U/mL。【结论】该研究是对吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的首次报道,也是国内首次利用大肠杆菌实现pro-MTGase的胞外可溶性表达。

新疆牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及ERIC-PCR基因分型研究

为了了解牛源大肠杆菌(E.coli)O157∶H7在新疆地区的污染状况以及遗传多样性,探究不同地区分离菌株的遗传关系,为控制牛源E.coli O157∶H7的传播提供试验依据。将采集的样品在EC肉汤中进行增菌(37℃、180 r/min),接着将增菌液划线接种到SMAC平板上,37℃培养箱中过夜培养18 h左右。挑取SMAC平板上白色或无色单菌落接种MUG培养基,37℃培养18 h左右,将无荧光样品接种到SMAC平板上,37℃培养18 h左右,隔天挑取白色或无色单菌落进行PCR鉴定,具有rfbE和fliC基因条带的即为阳性菌株。将阳性菌株进行肠杆菌基因间重复共有序列扩增(ERIC-PCR)指纹图谱聚类分析,分析菌株之间的同源性关系。ERIC-PCR结果显示,相似性100%的菌株有3组。从伊犁地区分离到的菌株差异性最大,具有6种分型;其次是乌鲁木齐,具有4种分型。菌株来源多样性最多的在D簇,由此可见通过ERIC-PCR分型,可以进行溯源观察。ERIC-PCR能够区分特定采样点或物种的分离物,它能够证明从不同来源的菌株之间,存在着某些相似的ERIC特性,并聚集在同一个簇群中。该研究中筛选出的E.coli O157∶H7菌株具有广泛的遗传多样性,该方法对于检测不同物种间的细菌差异非常敏感。由此可见ERIC-PCR可以作为E.coli O157∶H7常规监测和鉴定的一个有效的工具。

猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒E2基因抗原结构域A、B、C、D区并克隆于PGEM Teasy载体上,测序结果表明插入的为猪瘟病毒E2基因抗原结构域,切出目的基因,将目的基因克隆到表达质粒pProEX HTb中,获得重组质粒经PCR、酶切和序列分析鉴定E2基因抗原结构域插入的位置、大小和读码框均正确,SDS PAGE检测表明受体菌经IPTG诱导后能表达E2基因抗原结构域蛋白,Westernblot检测表明受体菌诱导表达E2基因抗原结构域蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性反应。

重组人血管内皮抑制素(rh-Endostatin)大肠杆菌表达体系发酵条件的优化

优化了重组人血管内皮抑制素的E.coli表达体系的发酵条件。利用E.coli表达体系得到了较高的产量,在9h左右的发酵周期内达到OD600值140,包涵体蛋白产量为3g/L。主要优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)的终浓度、诱导时间、培养温度、补料控制方法等条件,并且在诱导后提高培养温度到40℃,在非常短的培养周期内达到了高密度培养的目的。利用E.coli表达,继而通过复性获得有活性的重组人血管内皮抑制素,成本低、生产过程稳定可控、得到的蛋白性质稳定,符合工业生产的需要。