HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达及免疫原性分析

目的研究对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型HXB2株调控蛋白Tat原核表达产生影响的区域和Tat蛋白重要的抗原表位。方法用PCR方法获得Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)和Tat(38-101aa)DNA片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa),并转入E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物。采用间接ELISA方法用兔抗pET32a-Tat抗血清对三种肽段进行免疫原性分析。结果成功构建了pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa)质粒,分别表达出相对分子质量(Mr)为23×103、23×103和25×103的融合肽段,其浓度分别为4.26、3.35和5.11mg/ml。间接ELISA结果表明三种融合肽段与兔抗pET32a-Tat抗血清均呈特异性结合反应,其抗体滴度分别为1:128000、1:32000、1:64000,而抗血清与pET32a蛋白仅有较弱结合。结论半胱氨酸富集区(22-37位氨基酸)对Tat蛋白的原核表达有较显著影响;Tat蛋白的N端区、碱性区和C端区是其重要的抗原表位,其中N端区的免疫原性最强。

HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的构建HIV-1HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行高效表达和纯化。方法应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定。结果构建了pET32a-Tat(CN)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17mg/ml,相对分子质量为31ku。间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。结论成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论。

人白细胞介素15基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆人白细胞介素(IL)15全长cDNA,并在大肠杆菌中表达。方法从人外周血分离的淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出hIL-15全长cDNA。构建到原核表达载体pET28a(+)中,通过卡那霉素平板筛选及PCR鉴定,挑出阳性克隆进行扩增,DNA测序正确后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,扩增后IPTG诱导表达。通过SDS-PAEG及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。结果成功构建人IL-15表达载体,并表达于大肠杆菌中。SDS-PAEG及Western-blot分析显示表达的融合蛋白分子量为16·1ku,与理论值相符。结论获得了hIL-15融合蛋白,为hIL-15单克隆抗体的制备及其功能研究奠定了基础。

人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD 2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法:PCR扩增不含前导序列的HBD 2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD 2-cDNA),利用B g lⅡ和B amHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD 2-cDNA的克隆载体,利用N colⅠ和H indⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET 32-nsmHBD 2-cDNA,在大肠杆菌中BL 21(DE 3)中诱导表达含HBD 2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD 2多肽。采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD 2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD 2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD 2-cDNA几乎不含可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分。重组HBD 2对E.coli K 12 D 31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/m l时,90%细胞的生长被抑制。结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD 2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD 2多肽的原核高效表达。

猪α干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定

目的构建稳定、高效表达的重组猪α干扰素(rpoIFN-α)大肠杆菌表达菌株,并纯化鉴定该菌株表达的目的蛋白,进行生物学活性检测。方法提取猪肝脏细胞基因组DNA,PCR扩增猪α干扰素(poIFN-α)基因,克隆到pMD18-T载体上,测序鉴定后再亚克隆到pGEX-5X-1载体上,转化入E.coliBL21中后得到表达菌株,用IPTG诱导表达,收集的菌体超声破碎后取上清得粗制蛋白,用GST亲和层析法进行纯化,产物用Western blot进行鉴定,并在Hep-2/VSV系统上滴定效价。结果重组质粒pGEX-5X-1/poIFN-α经过EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切后可见501bp的目的片段,提取质粒测序鉴定,结果与GeneBank中的序列一致。转化入E.coliBL21中32℃条件下经IPTG诱导5h,提取总蛋白,SDS-PAGE检测显示带有GST标记的rpoIFN-α能高效表达,分子量约45ku,可溶性rpoIFN-α约占菌体蛋白的0.35,Western-blot鉴定显示有特异性条带。效价滴定结果表明该rpoIFN-α具有抗病毒活性,纯化后效价为7.5×106IU/ml,比活性达到1.1×107IU/mg。结论成功克隆了poIFN-α基因,并可在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的rpoIFN-α。

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

三种细菌HPI核心区ybtE基因核苷酸序列及推导氨基酸序列的比较研究

目的比较三种肠聚集性大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌HPI毒力岛核心区ybtE基因的同源性。方法PCR扩增肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)17-2ybtE基因的完整序列,克隆后测序。用ABIPRISM软件对该ybtE基因序列与已知的鼠疫耶尔森菌HPI的ybtE基因以及小肠结肠炎耶尔森菌HPI的irp5基因进行核苷酸序列和推导氨基酸序列比较。结果核苷酸序列,EAEC17-2与鼠疫耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性分别为99.8%和98.2%,鼠疫耶尔森菌与小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性为98.2%;推导氨基酸序列,EAEC17-2与鼠疫耶尔森菌及小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性分别为99.8%和97.6%,鼠疫耶尔森菌与小肠结肠炎耶尔森菌之间的同源性为97.8%。结论ybtE基因作为HPI的功能基因高度保守,EAEC中的HPI可能来源于YpsHPI。

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的 克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法 从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果 从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论 成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。

N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌E.coliDH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open read ing frame,ORF)大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),在得到的转化子E.coliBL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论:所构建的诱导型产酶菌株E.coliBL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株E.coliDH5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。

利用细菌／杆状病毒系统在昆虫细胞中表达人CYP2E1

目的:获得人CYP2E1重组酶,并用该重组酶的特征性探针底物对其进行代谢活性研究。方法:以人肝组织RNA为模板,通过RT-PCR得到CYP2E1 cDNA片断,然后与pFastBac质粒连接,得到pFastBac-CYP2E1重组质粒,将其转化E.coli DH 10Bac大肠杆菌,通过转座作用,获得重组Bacmid-CYP2E1,将其转染草地夜蛾细胞(Sf9)后,产生重组杆状病毒。将该病毒以及分别含有人CYPOR和人CYPb5的病毒共同感染Sf9细胞,收集共表达蛋白,以氯唑沙宗为底物鉴定重组酶的活性。结果:利用细菌/杆状病毒系统得到重组人CYP2E1的表达,其对氯唑沙宗的Km值为(72.4±8.7)μmol.L-1,Vmax值为(2.41±0.10)μmol.min-1.g-1蛋白。结论:利用杆状病毒系统成功表达了有催化活性的人CYP2E1重组酶,其活性与文献报道值相似。

武汉地区儿科ICU病房产ESBLs大肠埃希菌的耐药性及基因型检测

目的了解武汉地区儿科ICU病房产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌的耐药性及基因型。方法收集武汉地区三家医院儿科ICU病房156株大肠埃希菌，采用NCCLS规定的方法筛选和确认产ESBLs菌株，用K．B琼脂扩散法进行药物敏感性检测，应用聚合酶链反应（PCR）检测产酶株的基因型。结果产ESBLs大肠埃希菌的检出率为37，18％（58／156），其中87．93％（51／58）携带CTX-M基因，6．89％（4／58）携带SHV基因，1.72％（1／58）同时携带CTX-M和SHV基因。产ESBLs菌株对环丙沙星、青霉素类、酶抑制剂合剂、第三代头孢菌素均有不同程度的耐药，但对碳青酶烯类亚胺培南、伊他培南均敏感。结论武汉地区儿科ICU病房产ESBLs的大肠埃希菌耐药谱广，多重耐药明显，其中以CTX-M型的ESBLs最常见，应加强检测，合理治疗。

大肠埃希菌Ⅰ类整合子与耐药性分析

目的:了解Ⅰ类整合子在临床分离大肠埃希菌和健康人群大肠埃希菌中分布流行状况。方法:根据NCCLS推荐的琼脂稀释法进行药敏试验;PCR扩增Ⅰ类整合酶基因。结果:患者大肠埃希菌Ⅰ类整合子检出率为45.4%;健康人大肠埃希菌Ⅰ类整合子检出率为5.4%。108株患者大肠埃希菌对12种抗菌药物耐药率,最高为氨苄西林97.2%,最低为亚胺培南0.93%。结论:Ⅰ类整合子在患者大肠埃希菌中的存在已经相当普遍,健康人群大肠埃希菌也携带有Ⅰ类整合子,应加强基因水平耐药监测。