大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基K63突变体表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

采用PCR方法从产肠毒素大肠杆菌（ETEC）44815菌株基因组中扩增不耐热肠毒素A亚基（LTA）编码基因，并将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因插入到含有人CD5信号肽序列的pcDNACD5sp真核表达载体中，构建成pcDNACD5sp／LTA分泌性真核表达载体，然后采用定点突变方法将大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基第63位的丝氨酸改变为赖氨酸，构建成pcDNACD5sp／LTAK63突变体，经磷酸钙介导将pcDNACD5sp／LTAK63质粒转染HEK293T细胞进行表达。结果表明：试验克隆的大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因与GenBank中大肠杆菌不耐热肠毒素A亚基基因序列相比，碱基序列、氨基酸序列同源性均达99％；表达产物经Western-blot检测，结果说明构建的含有人CD5信号肽的LTAK63基因能够在真核细胞中进行分泌性表达。

交叉引物扩增法检测食品中大肠杆菌不耐热肠毒素的探讨

CPA技术与常规PCR技术相比,既避免了对昂贵的仪器设备的依赖性,又能减少检测费用,且由于其特异性高、灵敏度高,可大幅度提高检测速度。本文基于交叉引物扩增法技术及应用,设计了使用该方法检测食品中大肠杆菌不耐热肠毒素的实验,以期能够为相关人员提供借鉴与帮助。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基表达系统的研究进展

随着分子生物学的快速发展,各种工程菌株的遗传操作体系逐渐完善,蛋白质、酶和多肽制剂等产品的生产制备在满足科研需要的同时,也为生物制剂市场带来了巨大的经济效益[1]。原核和真核表达系统是使用最广泛和研究最成熟的表达系统,利用原核或真核表达系统获取各种发酵产物开始进入工业化生产阶段[2]。

大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及其纯化保存策略

编码完整大肠杆菌不耐热肠毒素 (LT)的基因被引入pET11c形成pET11 LT ,该质粒在E .coliBL2 1(DE3)中得到较高效率的表达 ,约 4 6mg L。用D(+) Immobilizedgalactose柱可以在很宽的pH范围 (pH7 3～ 10 4 )内用多种方法对LT进行纯化且保持其结构完整。溶于TEAN(pH7 3)或碳酸盐缓冲液 (pH10 4 )的LT ,冻干后保存于 4℃ ,可长久保持其完整结构 ,此为保存LT的较好策略。与GM1结合实验、CHO细胞及Patent mouse毒性检测实验证明纯化的LT具有生物学活性。

大肠杆菌耐热肠毒素b及其致动物腹泻的机理

介绍了大肠杆菌耐热肠毒素b(STb)的编码基因、理化性质、免疫学特征、分泌特征、毒性相关氨基酸残基、空间结构、膜受体以及STb致动物腹泻的机理。认为STb是一种十分重要的肠毒素,应进一步加强对STb及其致腹泻机理的研究。

猪源大肠杆菌耐热肠毒素基因的分子克隆

以ＰＣＲ方法克隆得到猪源大肠杆菌ＳＴ１基因缺失ＣｏｏＨ端最后两个编码密码和终止密码的ＤＮＡ片段，并以该片段为探针，筛选了以载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ构建的猪大肠杆菌Ｐ５５质粒ＤＮＡ文库，得到插入片段约５．５ｋｂ阳性克隆，亚克隆了约０．５ｋｂ含ＳＴ基因的ＴａｑⅠ酶切片段，并对该基因核苷酸序列进行了分析。应用竞争性ＥＬＩＳＡ测定了ＳＴ基因在不同启动子调控下的表达情况，在Ｔ７启动子调控下。

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明。

大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63毒性检测及佐剂效果研究

目的对已构建的大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63进行表达、纯化、毒性检测,并对其佐剂活性进行研究。方法采用已知的最佳诱导表达条件进行诱导表达,诱导表达产物经亲和层析、纯化浓缩后,进行毒性检测。将纯化后的mLT63联合幽门螺旋杆菌(Hp)亚单位疫苗UreB、Omp11经口途径免疫BALB/c小鼠,免疫后取血清、胃组织提取液、粪便提取液进行ELISA试验,检测其中的特异性抗体水平,将结果进行统计分析。结果经家兔回肠袢毒性试验验证本室构建大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63没有毒性,mLT63联合Hp亚单位疫苗UreB、Omp11免疫小鼠实验证实mLT63具有佐剂活性。结论本室构建、表达的大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63无毒,并具有免疫佐剂的活性。

牛源产Ⅱ型不耐热肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及重组毒素制备

产Ⅱ型不耐热肠毒素(LT-Ⅱ)大肠杆菌是一类能引起严重腹泻的人畜共患肠道致病菌。为了解LT-Ⅱ在牛源腹泻性大肠杆菌中的流行情况,本研究对2010-2012年间分离的138株大肠杆菌进行了LT-Ⅱ毒素基因的检测,对分离到的10株LT-Ⅱ阳性大肠杆菌进行了测序及分析。进一步将LT-Ⅱcl毒素基因双顺反子的ORF克隆入pET30a表达载体、转化Rossatta感受态并诱导表达重组LT-Ⅱcl毒素,经Y-1小鼠肾上腺皮质细胞对重组毒素进行了初步的毒性验证。结果显示,所分离的10株LT-Ⅱ阳性大肠杆菌中,有8株表达LT-Ⅱcl毒素,1株表达LT-Ⅱc4毒素,1株表达LT-Ⅱc6毒素。SDS-PAGE和Western Blot结果表明成功地制备出LT-Ⅱcl重组毒素,该重组毒素可以使Y-1小鼠肾上腺皮质细胞发生明显的病变,其细胞最小致死量为17.8 pg。本研究为中国国内首次分离到牛源产LT-Ⅱ型不耐热肠毒素大肠杆菌,为深入研究LT-Ⅱ毒素奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分泌表达与性质鉴定

目的 较高效率分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位并鉴定其性质。方法 将编码成熟大肠杆菌不耐热肠毒素 (LTB)的基因引入pET2 2b(+)并转化E .coliBL2 1(DE3) ;重组工程菌在改良M9 CAA培养基内进行表达 ;对分泌表达的LTB进行纯化后进行神经节苷脂 (GM1)结合活性、免疫原性与黏膜免疫佐剂活性的鉴定。结果 LTB既能分泌表达至胞周质又能以包含体形式表达 ,两者都与pelB信号肽准确分离。纯化出的LTB具有正常的GM1结合活性、免疫原性及黏膜免疫佐剂活性。结论 pET2 2b(+)质粒的pelB信号肽可使LTB以较高效率分泌表达。

大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的原核表达及其活性研究

为使大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,本实验通过PCR和重叠-延伸PCR扩增,制备了突变体LTR72/G192的基因片段,经酶切和测序结果表明构建的表达载体pLTR72/G192阅读框架正确,而且相应位点氨基酸获得了替换。IPTG诱导表达目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测,表达出突变体重组蛋白为约30 ku和10 ku的两个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量相吻合。Western blot检测结果表明两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应。目的蛋白经纯化后进行ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,突变重组蛋白与野生型LT相比其酶活性和毒性均明显降低。纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡,ELISA结果显示,突变体LTR72/G192能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高滴度的抗新城疫病毒的IgG和IgA。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的纯化及生物学活性鉴定

目的 纯化rLTB并对其生物学功能进行初步研究。方法 重组基因工程菌发酵后 ,以包涵体形式表达的rLTB经过洗涤、变性溶解后 ,分别采用QSepharoseTM HighPerformance阴离子交换层析和PhenylFF(highsub)疏水层析对其进行纯化并透析复性 ,然后采用SDS PAGE和HPLC检测纯度 ,并选用ELISA、动物实验和Western blotting实验对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 得到纯度达 97 85 %的rLTB ,复性的rLTB经检测具有良好的生物学活性。结论 得到纯度较高、生物学活性较好的rLTB 。

平板免疫溶血试验快速检测大肠杆菌不耐热肠毒素

琼脂糖为介质，进行固相平板免疫溶血试验测定毒素源性大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴ），同时与ＥＬＩＳＡ，兔肠结扎试验测定ＬＴ进行了比较。结果表明，平板免疫溶血试验特异性强，标准的ＥＴＥＣ发生溶血，非ＥＴＥＣ不发生溶血，灵敏度与ＥＬＩＳＡ相似，比肠结扎试验敏感８倍左右；对１５１份样品的检测说明平板免疫溶血试验与ＥＬＩＳＡ具有很高的符合性。此外对不同来源的红血球用于测定ＬＴ进行了研究。

大肠杆菌不耐热肠毒素对狂犬病病毒减毒疫苗株粘膜免疫效应的增强作用

将狂犬病病毒 SRV9减毒疫苗与大肠杆菌不耐热肠毒素 (L T)混合 ,分别经口腔滴入、灌胃、灌肠等途径免疫小鼠。通过检测外周血淋巴细胞特异性转化率、CTL反应、Ig G、Ig A、SIg A等免疫指标 ,并结合攻毒保护 ,探讨了狂犬病病毒经消化道不同途径接种产生的免疫效果以及 L T在粘膜免疫中的作用。结果表明 :肠道接种组的狂犬病病毒特异性免疫应答水平高于口腔和胃接种组的免疫应答水平 ,L

大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的表达及活性研究

利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换。诱导表达产物用SDS-PAGE检测,野生型LT蛋白及3个突变体均表达出约33.0Ku和13.0Ku的2个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量大小相吻合;Westernblot检测,2个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应,而13.0Ku的蛋白带还可与抗霍乱毒素(CT)抗体发生免疫学反应。ADP-核糖转移酶活性试验分析,各突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性试验检测,LTK63、LTR72和LTG192突变体蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最显著,LTG192蛋白毒性相对较大。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b-LTB表达载体、转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS-PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的 研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因工程菌的发酵工艺。方法 先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件 ,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件 ,并进一步对发酵工艺进行改良优化。结果 经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合 ,优化后工程菌菌体产量平均可达 40 5g/L ,目的蛋白的表达率平均为 3 0 6%。结论 建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺。

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展

大肠杆菌的耐热性肠毒素 (ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色 ,对人类和家畜的健康构成很大的威胁 .文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征 ,全面概述了ST的分子生物学研究进展 ,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义 .