大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分泌表达与性质鉴定

目的 较高效率分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位并鉴定其性质。方法 将编码成熟大肠杆菌不耐热肠毒素 (LTB)的基因引入pET2 2b(+)并转化E .coliBL2 1(DE3) ;重组工程菌在改良M9 CAA培养基内进行表达 ;对分泌表达的LTB进行纯化后进行神经节苷脂 (GM1)结合活性、免疫原性与黏膜免疫佐剂活性的鉴定。结果 LTB既能分泌表达至胞周质又能以包含体形式表达 ,两者都与pelB信号肽准确分离。纯化出的LTB具有正常的GM1结合活性、免疫原性及黏膜免疫佐剂活性。结论 pET2 2b(+)质粒的pelB信号肽可使LTB以较高效率分泌表达。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b-LTB表达载体、转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS-PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在鸭体内的吸收代谢及组织分布

研究重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(rLTB)在鸭体内的吸收代谢及组织分布,为rLTB的临床应用安全性提供依据。试验鸭分别肌注1,50,100 mg/kg rLTB后,以神经节苷脂GM1酶联免疫吸附法(GM1-ELISA)测定注射后不同时间点鸭血清中的rLTB含量;连续3次肌注rLTB后,观察临床症状和剖检病理变化,并采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑制备组织切片,HE染色观察组织病理学变化,免疫酶组织化学染色观察rLTB在各脏器内的分布及含量变化。结果表明:鸭血清中的rLTB含量变化及维持时间与rLTB注射剂量呈正相关。1 mg/kg注射组2 h达到峰值,维持至6 h开始下降,24 h后基本检测不到;50,100 mg/kg注射组分别于2 h和1 h达到峰值,并均维持至12 h才开始下降,48 h后基本检测不到。HE染色切片显示50 mg/kg注射组肝细胞轻度浊肿变性,肺脏轻微炎症;100mg/kg注射组肝细胞浊肿变性明显、肺脏重度炎症、脑组织出现局灶性坏死。免疫组化染色结果显示,在被检脏器中均检出rLTB,以大脑含量最高,脾脏和肝脏次之,心脏和肺脏检出量低。rLTB大剂量肌肉注射可引起鸭一定的组织学病变,对鸭的安全使用剂量应不超过50 mg/kg。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的纯化及生物学活性鉴定

目的 纯化rLTB并对其生物学功能进行初步研究。方法 重组基因工程菌发酵后 ,以包涵体形式表达的rLTB经过洗涤、变性溶解后 ,分别采用QSepharoseTM HighPerformance阴离子交换层析和PhenylFF(highsub)疏水层析对其进行纯化并透析复性 ,然后采用SDS PAGE和HPLC检测纯度 ,并选用ELISA、动物实验和Western blotting实验对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 得到纯度达 97 85 %的rLTB ,复性的rLTB经检测具有良好的生物学活性。结论 得到纯度较高、生物学活性较好的rLTB 。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的 研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因工程菌的发酵工艺。方法 先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件 ,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件 ,并进一步对发酵工艺进行改良优化。结果 经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合 ,优化后工程菌菌体产量平均可达 40 5g/L ,目的蛋白的表达率平均为 3 0 6%。结论 建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合表达载体的构建及应用

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的融合表达载体。方法 PCR扩增LTB基因 ,并在其 3′端去掉终止密码子 ,引入编码TAPI接头 ,通过EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点重组于PinpointXa Ⅰ载体上 ,将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合 ,转化E .coliJM10 9,SDS PAGE及Westernblotting分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒 ,并获得了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内佐剂疫苗奠定了实验基础。

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的 获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位 (HspA)的融合蛋白。方法 PCR扩增ltB和hspA基因 ,依次构建至表达载体pIM 1,转化大肠杆菌 ,SDS PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1 ELISA和D(+) 半乳糖亲和层析方法检测重组LTB HspA融合蛋白LTB组分与GM1 神经节苷脂结合活性。结果 重组LTB HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的 2 5 %。免疫印迹检测结果证实为重组LTB HspA融合蛋白。GM1ELISA和D(+) 半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB HspA融合蛋白具有与GM1 神经节苷脂结合的活性。结论 LTB HspA融合蛋白的表达研究 。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达

以大肠杆菌和乳酸菌穿梭表达型载体pMG36e为基本模型,采用重叠延伸PCR方法拼接相关调控元件构建一种乳酸杆菌组成型分泌表达载体;将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体中,构建重组质粒pMG36e-UP/L-LTB,电转化于干酪乳杆菌393中,筛选获得重组干酪乳杆菌,应用western blot方法鉴定LTB表达情况。Western-blot分析显示,约有12 KDa的目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别。表明LTB蛋白在重组干酪乳杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。

产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位可有效诱导和增强对肠道病毒71型的黏膜免疫应答

目的研究产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的免疫原性。评价肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1联合LTB的鼻腔免疫效果。方法构建重组质粒pET32a-LTB,表达的6×His-LTB融合蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化后免疫新西兰大白兔制备抗血清,ELISA检测抗血清效价。用纯化的EV71 VP1、LTB联合EV71 VP1、生理盐水分别经鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集血清、肺和小肠黏膜冲洗液,采用间接ELISA检测IgG和分泌性IgA(sIgA)。结果已成功构建重组质粒pET32a-LTB。表达的6×His-LTB融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,免疫兔所制备的抗血清效价为1∶125 000。EV71 VP1联合LTB组的小鼠特异性IgG和sIgA水平较EV71 VP1单独免疫组和对照组有明显增高。结论在E.coli BL21(DE3)中成功表达了6×His-LTB融合蛋白,纯化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐剂活性。通过滴鼻免疫,LTB可有效增强特异性血清抗体反应,诱导黏膜免疫应答。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的 对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法 应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果 PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论 所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达、纯化及其黏膜免疫佐剂作用

目的原核表达、纯化大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),并评价其黏膜免疫的佐剂作用。方法从产毒素大肠杆菌44815菌株中扩增出LTB基因,克隆至质粒pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-LTB,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达的LTB经纯化后进行神经节苷脂GM1结合活性及黏膜免疫佐剂活性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组LTB主要为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的15%;纯化的LTB纯度可达95%以上,可与兔抗CTB血清发生特异性反应,且具有GM1结合活性及良好的黏膜免疫佐剂活性。结论在大肠杆菌中成功表达了重组LTB蛋白,纯化的LTB具有良好的黏膜免疫佐剂活性。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位对鸭禽流感疫苗的免疫效果

从大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的生物安全性、对鸭的毒副作用以及对鸭禽流感疫苗免疫增强效果等方面进行研究,结果表明,LTB制品中未检测到自身编码基因和抗性标记基因残留;高剂量LTB能诱导产生抗LTB自身抗体,并与剂量呈正相关;当使用剂量增大至50 mg/kg时,试验鸭表现出一定的神经症状及组织学病变;肌肉注射1 mg/kg LTB可显著提高禽流感灭活疫苗免疫鸭的血凝抑制(HI)抗体滴度。研究表明LTB具有增强禽流感疫苗免疫效果的潜力,且对鸭的安全使用剂量不超过50 mg/kg。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素融合基因的构建及表达

为了构建含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与产气荚膜梭菌β1、β2毒素融合基因的表达菌株,试验将亚克隆LTB基因融合到β2-β1毒素基因的上游,构建了pET30a-LTB-β2-β1原核表达载体,经IPTG诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE检测和Western-blot分析。结果表明:重组菌株可以表达LTB-β2-β1融合蛋白,且该融合蛋白可以被相应的抗体识别。

产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果

目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。