一株宽宿主谱裂解性大肠杆菌噬菌体的进化分析

裂解性噬菌体能够特异性裂解细菌,本研究分析了一株从自然界中分离的宽宿主谱裂解性大肠杆菌噬菌体的种属和进化关系。前期用Adams双层平板琼脂法从猪场污水中分离纯化出一株裂解性噬菌体v B_Eco M_JS09,裂解谱分析能够裂解禽致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌。扩增分析gene18、gene 23序列,并根据gp18和gp23氨基酸序列构建系统进化树,分析JS09的遗传进化关系。结果表明噬菌体v B_Eco M_JS09基因组为ds DNA,属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、T4-like噬菌体、T-evens亚群。其gp18氨基酸序列与大肠杆菌噬菌体RB69同源性最高,为100%;gp23氨基酸序列与大肠杆菌T4噬菌体同源性最高为96%。该结果为禽致病性大肠杆菌和产肠毒素大肠杆菌的防控提供了生物学基础。

检测牛血清中污染大肠杆菌噬菌体方法的建立

用大肠杆菌标准噬菌体株选择确定的大肠杆菌44451和44369作为宿主菌，建立了检测牛血清污染大肠杆菌噬菌体的直接噬菌斑法和增殖法。此法操作简便、灵敏度高。

RNA病毒检测质控物质—大肠杆菌噬菌体MS2标准样品的研制和应用

目的研制大肠杆菌噬菌体MS2标准样品,以其作为RNA病毒检测质控物质,建立RNA病毒检测全过程的质量控制体系。方法利用液体培养法制备大肠杆菌噬菌体MS2标准样品;采用双层琼脂法对标准样品进行稳定性、均匀性测定并定值;将标准样品添加于贝类样品中,应用于贝类诺如病毒实时荧光检测全过程质量控制。结果该标准样品稳定性与均匀性良好,定值为(1.57±0.0288)×10^(11) pfu/m L;保质期为12个月;在4种不同贝类样品中,病毒提取效率在3.70%~7.84%之间,符合国际标准ISO 15216:2-2013的病毒提取效率大于1%的要求。结论该研究制备的大肠杆菌噬菌体MS2标准样品可以对RNA病毒检测全过程进行良好的质量控制,具有良好的应用前景。

诺如病毒检验用大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的研制

目的制备均匀性和稳定性符合要求的大肠杆菌噬菌体MS2标准物质,用于诺如病毒检验过程质量控制。方法对大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)进行分子生物学确认。采用冷冻干燥技术制成微球状标准物质,并进行均匀性、长期稳定性、短期稳定性检验。以牡蛎等5种样品作为基质,对使用效果进行确认。结果制备的样品呈球形、白色、大小均一,其均匀性符合要求,经-20℃12个月长期储存,样品稳定,经4℃28 d以及37℃5 d的短期储存,样品稳定。阈值循环数(threshold cycle,Cq)值与均匀性检平均值差异不大。牡蛎等5种样品使用效果确认实验表明,该标准物质可以作为食品诺如病毒检验过程质量控制使用。结论大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)分子水平鉴定结果符合大肠杆菌噬菌体MS2特征。均匀性、长期稳定性、短期稳定性及适用性实验结果符合作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质的要求。

大肠杆菌噬菌体BP16对鸡大肠杆菌病的防治效果

【目的】探究大肠杆菌噬菌体BP16对O2血清型禽致病性大肠杆菌感染引起的鸡大肠杆菌病的防治效果,以及噬菌体BP16的最佳治疗剂量。【方法】将O2血清型禽致病性大肠杆菌新鲜培养物稀释成5×10^(10)、5×10^(9)、5×10^(8)、5×10^(7)和5×10^(6) CFU/mL 5个浓度梯度,以测定禽致病性大肠杆菌的半数致死量(LD_(50)),确定其感染剂量;选取常用的对革兰阴性菌有抑菌或杀菌作用的药敏纸片进行药敏试验,筛选出阳性对照药物;经无菌试验和安全性试验确定噬菌体裂解液的无菌性及安全性,用于后续试验。将80只雏鸡随机分为5个试验组与3个对照组,试验组在雏鸡攻毒前后不同时间腹腔注射大肠杆菌噬菌体BP16,3个对照组分别腹腔注射氟苯尼考、大肠杆菌菌液、生理盐水,其余条件一致,连续饲养7 d,记录雏鸡的死亡率,评价大肠杆菌噬菌体BP16对大肠杆菌人工感染试验鸡的防治效果。【结果】O2血清型大肠杆菌的LD_(50)为1.5×10^(8) CFU/mL,筛选出氟苯尼考作为阳性对照药物,噬菌体裂解液中无菌,噬菌体悬液对雏鸡安全,可用于后续防治试验。雏鸡感染大肠杆菌前6 h使用噬菌体能有效预防大肠杆菌病,在感染同时至感染后6 h内使用噬菌体,能有效治疗大肠杆菌病,且噬菌体治疗效果优于氟苯尼考;当大肠杆菌攻毒剂量为1.5×10^(8) CFU时,噬菌体剂量为1.5×10^(9) PFU时治疗效果为最佳。【结论】大肠杆菌噬菌体BP16对大肠杆菌病具有防治作用,本研究为进一步应用噬菌体防治大肠杆菌病及开发大肠杆菌噬菌体制剂提供了科学依据。

1株感染多种致病性大肠杆菌噬菌体的生物学特性研究

旨在测定此前从断奶前仔猪粪样中分离得到的1株大肠杆菌噬菌体C6在致病性大肠杆菌上的生物学特性,并比较该噬菌体在不同致病菌上的感染特性。利用电镜形态观察和基因组测序确定其分类,用点滴法和双层平板法测定其在致病性大肠杆菌上的宿主谱,通过噬菌斑形态、最佳感染复数(MOI)、成斑率(EOP)、吸附率、一步生长曲线以及抑菌曲线等来评价噬菌体在多株致病菌上的感染特性。结果显示:噬菌体C6可感染1株非致病性大肠杆菌和4株致病性大肠杆菌,包括大肠杆菌O157(E.coli W1)、2株产志贺毒素大肠杆菌(STEC W3、STEC W5)和1株肠致病性大肠杆菌(EPEC 143)。通过比较噬菌体C6在4株致病菌上的各项感染特性指标发现:噬菌斑大小和成斑率E.coli W1>EPEC 143>STEC W3>STEC W5;吸附率E.coli W1>EPEC 143、STEC W3、STEC W5;最佳MOI EPEC 143、STEC W3、STEC W5>E.coli W1;液体LB中生长能力和抑菌能力E.coli W1>STEC W3>EPEC 143、STEC W5。噬菌体C6为T4样噬菌体,可感染多株致病性大肠杆菌,在不同致病菌上的感染特性存在差异,但均能显著抑制致病菌的生长。

龋齿DNA疫苗(PGJAP)中污染大肠杆菌噬菌体的检测方法的建立

龋齿DNA疫苗工程菌采用的大肠杆菌DH-5α在生产过程中极易污染大肠杆菌噬菌体,所以应对原始菌种、主菌种和工作菌种及大量生产时的发酵液作大肠杆菌噬菌体检测。用大肠杆菌噬菌体VCSM13为标准噬菌体株,对大肠杆菌C3000和DH-5α分别作噬菌斑检测和pfu值计算,验证并确定以VCSM13作为标准噬菌体株,C3000作为检测菌株,对龋齿DNA疫苗原始菌种、主菌种(第一代)、工作菌种(2007001)和其发酵液(200703)分别作噬菌体检测,并建立了检测大肠杆菌噬菌体的直接噬菌斑法。结果显示VCSM13在DH-5α的噬菌斑计数为76,pfu/ml为7.6×1013,C3000的噬菌斑计数为81,pfu/ml为8.1×1013,龋齿DNA疫苗的原始菌种、主菌种、工作菌种和发酵液,噬菌斑计数全部为0。Pfu也为0。阳性对照为74,pfu/ml是7.4×1013,阴性对照为0。通过对阳性对照样本作增殖法试验及挑斑接种验证后,证明此法操作简单,灵敏度高。

新生牛血清中大肠杆菌噬菌体检测方法的建立

本研究用大肠杆菌标准噬菌体株选择确定的大肠杆菌C-3000作为宿主菌,采用增殖法和噬斑法与双层琼脂平板法,对多个厂家的新生牛血清进行了大肠杆菌噬菌体检测,建立了兽用生物制品细胞培养用新生牛血清中大肠杆菌噬菌体的检测方法。

荷电材料对水中大肠杆菌及大肠杆菌噬菌体f2的去除效果

目的实验评价荷电材料对水中大肠杆菌及大肠杆菌噬菌体f2的去除效果。方法采用自制带正电的微孔滤膜和滤板，通过正负电荷的相互吸引作用吸附细菌、病毒。结果孔径小于3.0μm的荷电滤膜及不同厚度的荷电滤板对水中大肠杆菌及大肠菌噬菌体f2有很好的去除效果，在一定条件下，去除率均可达到100%，结论荷正电材料能有效吸附细菌、病毒，可用于水或其它介质中细菌、病毒的去除、分离、浓缩及检测。

猪肠道大肠杆菌噬菌体对产肠毒素大肠杆菌的抑菌作用

此前本实验室从健康猪肠道及粪样中分离纯化得到57株大肠杆菌噬菌体,发现其中有12株噬菌体可裂解产肠毒素大肠杆菌(ETEC),本研究旨在探究这些大肠杆菌噬菌体的宿主谱及抑菌效力,以期了解肠道内大肠杆菌噬菌体对机体的保护作用。以89株大肠杆菌为宿主菌(其中包括5株ETEC),采用点滴法、双层平板法和液体扩增法测定噬菌体的宿主谱,利用浊度法测定噬菌体对ETEC的抑菌效力,并对噬菌体分类进行鉴定。12株噬菌体均能裂解一种或多种ETEC,但是均无法通过感染ETEC而增殖。S143_1、S143_2、S144_2、S35、S86_1、L86及S172等7株噬菌体虽然无法通过ETEC产生子代噬菌体,但在感染复数(MOI)为10或100时仍对ETEC具有显著的抑菌效力。12株噬菌体中有8株为T4样噬菌体,其他4株噬菌体均属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。本研究从猪肠道内分离到12株大肠杆菌噬菌体,虽然无法感染ETEC,但仍可裂解ETEC,其中,7株在MOI为10或100时可有效地抑制ETEC生长。

SD抗菌布对大肠杆菌噬菌体及乙型肝炎表面抗原的灭活效果

以未洗涤的ＳＤ抗菌布（主要成分为洗必泰）作用５分钟，可将大肠杆菌噬菌体全部灭活。洗涤８０次者，作用３０分钟的灭活率仍达８８．０５％。其对ＨＢｓＡｇ的破坏作用甚小，无实用意义。

火山渣吸附地下水中大肠杆菌噬菌体特性研究

为了分析火山渣吸附去除地下水中大肠杆菌噬菌体作用特性,通过室内实验,考察火山渣吸附地下水中vB_EcoM-ep3大肠杆菌噬菌体效果,同时用等量沸石与石英砂做对照,进一步分析地下水中水化学因素(Fe^(2+)、Fe^(3+)、Mn^(2+)、SO_(4)^(2-)、NH_(4)^(+)、NO_(3)^(-)、NO_(2)^(-)、Ca^(2+)、Mg^(2+)、CO_(3)^(2-)、HCO_(3)^(-)和pH值)对其吸附效果影响;通过微观检测技术,分析大肠杆菌噬菌体生物学特性和火山渣吸附前后微观结构变化。研究结果表明:火山渣吸附效率优于沸石和石英砂,最大饱和吸附量达到2.245×10^(5) pfu/g;水化学因素对火山渣吸附效果影响存在差异性,其中Fe^(2+)、Fe^(3+)起到促进作用,SO_(4)^(2-)、三氮和碱度起到抑制作用,低浓度Mn^(2+)(C_(Mn)^(2+)<10 mg/L)和Ca^(2+)(CCa^(2+)<100 mg/L)起到轻微促进作用,超过该浓度则表现为抑制作用;pH值对火山渣吸附效果影响较大,pH值越大,吸附效果越差。vB_EcoM-ep3大肠杆菌噬菌体头部为等边六角形,全身直径约为(53±2)nm,尾部长约为(107±3)nm,由尾管和尾丝组成,可伸缩。具有蜂窝状结构的火山渣吸附大肠杆菌噬菌体后表面孔隙大部分被填充。

过氧戊二酸对大肠杆菌噬菌体f2杀灭机理

观察结果表明过氧戊二酸对大肠杆菌噬菌休ｆ２有较强的杀灭作用，并影响其吸附特性和感染能力。电镜观察过氧戊二酸处理后ｆ２颗粒聚集成团，变形破碎或残缺不全，这可能是ｆ２灭活的主要原因。

鸡大肠杆菌噬菌体生物特性的研究及临床应用

研究采用前期试验分离到的大肠杆菌噬菌体进行试验,通过检测噬菌体生物特性从而指导制定噬菌体临床预防和治疗试验。结果表明,噬菌体在pH值4~9、热稳定性在37℃以下、0~75 min为1个生长周期,最佳感染复数为1,此时噬菌体的效价稳定性最好;通过攻毒预试验和治疗试验,预防组效果不明显,存活率为55%;灌胃口服C、D和E组治疗效果为高剂量组比低剂量组效果好,存活率分别为60%、75%和80%;注射治疗组效果最好,存活率为85%。研究表明,噬菌体有治疗禽大肠杆菌病的作用。

大肠杆菌噬菌体EW3-f4的筛选分离及其抑菌作用初探

目的:从生活污水中筛选分离大肠杆菌噬菌体,并探索其杀菌抑菌的能力。方法:采用半固体琼脂双层平板法,以大肠杆菌为宿主菌筛选分离一株噬菌体,测定其滴度、最佳MOI了解其生物学特性,通过透射电镜观察对其进行形态学分析,并评估其在固体和液体培养基中的抑菌杀菌能力。结果:在污水中分离获得了一株烈性大肠杆菌噬菌体EW3-f4,双层平板上噬菌斑斑体透明,边缘清晰,直径为0.7~1.3 mm,最佳MOI为0.1,透射电镜显示EW3-f4有多面体的头部和可收缩的尾部,属于肌尾噬菌体科的A2形态类的噬菌体。噬菌体EW3-f4在固体培养基上可以获得平均直径约为9.75 mm的抑菌圈,而在液体培养基中,EW3-f4在7 h内就能将培养液裂解至澄清。结论:大肠杆菌噬菌体EW3-f4的抑菌杀菌能力较强,可以作为控制大肠杆菌污染的生物控制剂进行进一步的应用性研究。

用大肠杆菌噬菌体和细菌的检验评价饮用水的安全性

我们从秘鲁利马的五条输配水管线中收集到２０份水样，对其中的大肠杆菌噬菌体数目进行了测定。这些水样的细菌数目通过如下方法进行检验：Ｐ／Ａ检验、Ｈ２Ｓ试纸检验、ＴＣ／ＭＰＮ检验与ＦＣ／ＭＰＮ检验。４７％的水样中含有大肠杆菌噬菌体，作为唯一存在的指示生物。在这种饮用水中的大肠杆菌噬菌体的发生率可以反映出残存于处理过程中对人体具有致病性病毒存在的可能性。在细菌学检验中，我们发现。

绒山羊源大肠杆菌噬菌体φPTK的分子生物学特性及对小鼠大肠杆菌感染的防治效果

【背景】抗生素耐药问题是影响人类及养殖业健康的重要因素,噬菌体能特异性裂解细菌,成为抗生素替代品研究热点,是解决抗生素耐药难题、促进养殖业健康发展的新途径。【目的】通过研究绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体φPTK(phage target of K1)的分子生物学特性,同时利用小鼠感染模型研究φPTK对小鼠大肠杆菌感染的防治效果,为绒山羊大肠杆菌病的防控提供新策略。【方法】用聚乙二醇-氯化钠(PEG 8000-NaCl)浓缩φPTK后,采用透射电子显微镜观察其超微形态结构;运用苯酚-氯仿法提取φPTK核酸后通过IlluminaHiSeq高通量测序分析其全基因组结构,使用Mauve比较基因组学分析,通过MEGA绘制噬菌体进化树;通过构建小鼠感染模型分析φPTK对小鼠感染大肠杆菌的防治效果。【结果】透射电镜显示φPTK头部为正多面体形,直径90 nm,有长约112nm、直径约18nm的可收缩长尾;φPTK基因组全长169688bp,GC含量37.72%,有264个开放阅读框,含穿孔素-裂解酶(holin-lysin)裂解系统,有抗穿孔素蛋白和裂解抑制辅助蛋白,未发现抗生素耐药基因和毒力基因;比较基因组分析表明,φPTK为一株新的绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体;小鼠大肠杆菌感染前和感染后分别使用φPTK进行预防和治疗的试验表明,未使用φPTK的阳性对照组小鼠全部死亡,预防组和治疗组小鼠存活率分别为80%和60%。【结论】噬菌体φPTK是一株能够在小鼠大肠杆菌感染中具有较好预防效果的有尾噬菌体目(Caudovirales)肌尾噬菌体科(Myoviridae)绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体,本研究为绒山羊噬菌体生物制剂的创制奠定了基础。

产志贺毒素大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_PHB05的生物学特性及全基因组分析

产志贺毒素大肠杆菌又称产Vero细胞毒素大肠杆菌，是一种可引起水样腹泻、溶血性尿毒综合征、出血性结肠炎等的人兽共患肠道致病菌。以一株产志贺毒素大肠杆菌为宿主菌，从湖北桌规模化养猪场的污水中分离得到一株烈性产志贺毒素大肠杆茵噬茵体，命名为vB_EcoM_PHB05。采用双层平板法筛选并纯化得到一株噬菌体．采用透射电镜观察噬菌体颗粒：使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序，同时对噬菌体最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线、裂解谱等生物学特性进行研究。结果表明，噬茵体vB_EcoM_PHB05在电镜下可见有一正多面体立体对称头部（直径约72nm），含收缩性尾部（尾长约45nm，尾宽20nm）．为肌尾科噬菌体；提取基因组，酶切鉴定该噬菌体核酸类型为双链DNA；其最佳感染复数为0．1；一步生长曲线试验结果显示，噬菌体vB_EcoM_PHB05潜伏期约为20min，平均裂解量约58PFU／cell；基因测序结果表明．该噬菌体全基因组全长147659bp，G＋C含量37．5％。噬菌体vB_EcoM_PHB05除对本身宿主茵产志贺毒素大肠杆菌（Escherichia coli034）产生裂解外，还裂解其它产志贺毒素大肠杆菌和沙门茵。噬菌体vB_EcoM_PHB05为一株广谱烈性噬菌体，其基因组中不合耐药基因及毒力基因，具有开发为抗产志贺毒素大肠杆菌制剂的潜力。

禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶的表达及其活性分析

为研究禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09编码的裂解酶对宿主大肠杆菌的裂解作用,克隆表达了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09的裂解酶,并检测了裂解酶的菌体内外裂解活性。利用PCR扩增了禽致病性大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_JS09裂解酶基因(Lysin基因),构建了重组表达质粒pET-32a(+)-LysJS09,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。在37℃IPTG浓度为1.0mmol/L诱导4h表达效果最好。重组融合蛋白LysJS09在BL21(DE3)中获得了高表达,在N端具有His标签,其分子质量约为38.9ku。重组融合蛋白以分泌型方式表达,经His-trap HP(GE)亲和层析柱纯化后获得的重组蛋白LysJS09的纯度为97%。裂解活性试验表明,该裂解酶单独使用和加入EDTA(0.1mol/L)均无体外酶活性;但菌体内裂解试验表明,表达的裂解酶对宿主菌具有一定的裂解作用。