诺如病毒检验用大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的研制

目的制备均匀性和稳定性符合要求的大肠杆菌噬菌体MS2标准物质,用于诺如病毒检验过程质量控制。方法对大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)进行分子生物学确认。采用冷冻干燥技术制成微球状标准物质,并进行均匀性、长期稳定性、短期稳定性检验。以牡蛎等5种样品作为基质,对使用效果进行确认。结果制备的样品呈球形、白色、大小均一,其均匀性符合要求,经-20℃12个月长期储存,样品稳定,经4℃28 d以及37℃5 d的短期储存,样品稳定。阈值循环数(threshold cycle,Cq)值与均匀性检平均值差异不大。牡蛎等5种样品使用效果确认实验表明,该标准物质可以作为食品诺如病毒检验过程质量控制使用。结论大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)分子水平鉴定结果符合大肠杆菌噬菌体MS2特征。均匀性、长期稳定性、短期稳定性及适用性实验结果符合作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质的要求。

RNA病毒检测质控物质—大肠杆菌噬菌体MS2标准样品的研制和应用

目的研制大肠杆菌噬菌体MS2标准样品,以其作为RNA病毒检测质控物质,建立RNA病毒检测全过程的质量控制体系。方法利用液体培养法制备大肠杆菌噬菌体MS2标准样品;采用双层琼脂法对标准样品进行稳定性、均匀性测定并定值;将标准样品添加于贝类样品中,应用于贝类诺如病毒实时荧光检测全过程质量控制。结果该标准样品稳定性与均匀性良好,定值为(1.57±0.0288)×10^(11) pfu/m L;保质期为12个月;在4种不同贝类样品中,病毒提取效率在3.70%~7.84%之间,符合国际标准ISO 15216:2-2013的病毒提取效率大于1%的要求。结论该研究制备的大肠杆菌噬菌体MS2标准样品可以对RNA病毒检测全过程进行良好的质量控制,具有良好的应用前景。

基因工程改造促进大肠杆菌发酵纤维素水解液合成1,2,4-丁三醇

1,2,4-丁三醇(BT)是广泛应用于各领域的高附加值化合物之一,利用纤维素水解液发酵生产BT需要一株能够耐受其中抑制物的菌株。在水解液中常见抑制因子糠醛存在下,大肠杆菌的发酵严重受限。本研究首先在含有BT合成途径的大肠杆菌中过表达四种糠醛耐受相关的基因:yghA、thyA、mdtJI和pntAB。在0.4g/L糠醛压力下,所有改造菌株的生长均有不同程度的提升,其中过表达pntAB基因的菌株生长最好,同时有助于BT合成酶的酶活力或转录水平的提高,BT产量达到11.0g/L。当以玉米芯纤维素水解液为底物时,过表达yghA、thyA和pntAB均明显促进了大肠杆菌的生长与BT产量的提高,其中yghA基因表现最好,在摇瓶中获得了3.36g/L的BT,在5L发酵罐中BT产量达到15.3g/L,转化率为63.8%。该策略为玉米芯纤维素水解液发酵生产BT提供了借鉴。

大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖基因组整合型菌株构建及发酵优化

2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose,2’-FL)是一种岩藻糖化人乳低聚糖,具有预防肠道疾病、提高免疫力、促进大脑发育等重要生理功能。基于基因组水平,通过敲除大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中2’-FL合成前体物质相关代谢基因,如β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase,lac Z)、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因(undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase,wca J)和GDP-甘露糖基水解酶基因(GDP-mannose mannosyl hydrolase,nud D),构建2’-FL合成底盘细胞;在此基础上,将外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-Fucosyltransferase,wbg L)和磷酸甘露糖变位酶基因(phosphomannomutase,man B)、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因(annose-1-phosphate guanylyltransferas,man C)、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因(GDP-mannose 4,6-dehydratase,gmd)和GDP-岩藻糖合酶基因(GDP-L-fucose synthase,wca G)引入到大肠杆菌基因组中,探究在基因组水平过表达2’-FL合成基因对2’-FL产量的影响。结果表明,2’-FL在所构建菌株B-05的摇瓶含量达到了1.99 g·L^(-1)。进一步通过摇瓶发酵优化确定了最优发酵条件:IPTG诱导浓度为0.4 mmol·L^(-1)、诱导时OD600为2.4,诱导温度为28℃。在此条件下,摇瓶中2’-FL合成量达到了3.92 g·L^(-1)。最后在5 L发酵罐中,2’-FL含量达到了43.48 g·L^(-1)。研究表明通过将外源2’-FL相关合成基因导入基因组中进行过表达,实现了2’-FL高效合成,为构建整合型2’-FL菌株提供了数据支撑。

大肠杆菌烈性噬菌体vB_EcoM_JN03的分离、鉴定及其抑菌效果研究

【目的】大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种重要的食源性致病菌。抗生素的不当使用导致E.coli O157:H7多重耐药和泛耐药成为一个日益严重的问题,研究其天然杀菌剂——烈性噬菌体,对于防控多重耐药E.coli O157:H7污染具有理论意义和实践应用价值。【方法】以多重耐药E.coli O157:H7为宿主菌,采用双层琼脂平板法,从污水中分离烈性噬菌体,对其生物学特性进行表征和全基因组序列分析,并评价该噬菌体应用于食品中对E.coli O157:H7的抑菌效果。【结果】成功分离纯化了一株可裂解E.coli O157:H7的噬菌体,命名为vB_EcoM_JN03(GenBank登录号:OR885871)。vB_EcoM_JN03属于有尾噬菌体目,肌尾病毒科;其最佳感染复数(MOI)为0.01,潜伏期为30 min,120 min后到达平稳期,裂解量80 PFU/cell;其在30~60℃和pH 4~12范围内效价稳定。vB_EcoM_JN03的基因组为双链DNA,全长158142 bp,G+C含量44.63%,编码206个开放阅读框(ORF),不含已知编码的毒力、抗生素耐药和溶源性基因。vB_EcoM_JN03在4℃下可显著抑制牛奶和牛肉样品中污染的E.coli O157:H7。【结论】经分离、鉴定的E.coli O157:H7烈性噬菌体vB_EcoM_JN03对宿主菌具有良好的抑制作用,有望作为一种天然杀菌剂防控E.coli O157:H7污染食品。

噬菌体治疗鸡大肠杆菌病研究进展

噬菌体治疗鸡大肠杆菌病是当前研究的一个热点。本文综述了近年来该领域的研究进展,介绍了鸡大肠杆菌病的病原性及其对养殖业的危害,详细阐述了噬菌体的特点及其在鸡大肠杆菌病治疗中的应用潜力。噬菌体具有高度专一性、低毒性和广泛的宿主范围,可以针对不同的大肠杆菌菌株进行定向治疗。尽管噬菌体治疗鸡大肠杆菌病在实践中仍面临稳定性、安全性和规模化生产等问题,但作为1种新型治疗方法,它具有广阔的应用前景。

大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体SF08的分离、表征及在食品中的应用

本研究通过双层平板法从湖水中分离、纯化出一株大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体,并命名为SF08。对其生物学特性、基因组序列及在即食鸡爪中的抑菌效果进行分析。结果表明,SF08由长约124 nm的可收缩尾巴和直径约76 nm的多面体头部组成。最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)为0.01;潜伏期为20 min,裂解期为20~110 min,爆发量为66 PFU/cell;在pH 3~12和30~70℃条件下能保持较高的活性。基因组全长59704 bp,G+C含量为56.52%,共有72个开放阅读框(ORF)。SF08在4℃下可以极显著地抑制即食鸡爪中模拟污染的大肠杆菌O157:H7(P<0.01)。本研究表明SF08具有较好的生物学特性及安全性,为后续研发和制备天然杀菌剂提供理论基础和参考。

高效裂解性宽谱大肠杆菌噬菌体筛选方法探究

本试验以11株兔源致病性大肠杆菌为宿主菌,利用滴定法和双层平板法从莱芜和青岛规模化兔场污水中分离到2株噬菌体v B-Eco M-t E6和v B-Eco M-tE10。通过透射电镜观察,两株噬菌体均属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科。噬菌体v B-Eco M-tE6和v B-Eco M-t E10的效价为5.42×108PFU/mL和8.26×109PFU/m L,能够裂解5种以上的兔致病性大肠杆菌,裂解性强、效价高、裂解谱广泛,具有较高的开发和利用价值。

重组大肠杆菌S3-2产羰基还原酶发酵工艺优化及动力学研究

以重组大肠杆菌S3-2为发酵菌株,通过单因素实验和正交实验对重组大肠杆菌S3-2产羰基还原酶的1 L发酵罐发酵工艺进行优化,并通过Logistic方程和Luedeking-Piret方程对重组大肠杆菌S3-2分批发酵产羰基还原酶的动力学过程进行模拟。结果表明,重组大肠杆菌S3-2的最佳发酵工艺为:IPTG在OD600值为1.0时诱导、IPTG终浓度为0.30 mmol·L^(-1)、种子液OD600值为3.0时接种、诱导温度为26℃,在此条件下,菌体细胞干重为1.586 g·L^(-1)、羰基还原酶酶活为0.712 U·mL^(-1);菌体生长、羰基还原酶酶活及甘油消耗的动力学模型的拟合度分别为0.9883、0.9917和0.9807,说明该模型对重组大肠杆菌S3-2的发酵动力学模型拟合良好,为后续中试放大研究提供了理论依据。

大肠杆菌、沙门菌噬菌体复合剂在肉鸡大肠杆菌、沙门菌防控中的应用效果分析

为探究大肠杆菌、沙门菌噬菌体复合剂在肉鸡大肠杆菌、沙门菌防控中的应用效果,本试验选用200羽44日龄商品代肉鸡对大肠杆菌和沙门菌的防控效果进行评估。结果显示,大肠杆菌、沙门菌噬菌体复合剂对肉鸡的死淘率没有不利影响,第3周和第4周时大肠杆菌、沙门菌噬菌体复合剂组肉鸡较对照组平均周增重显著升高,该噬菌体复合剂安全性较高,并且对大肠杆菌和沙门菌具有较好的防治效果。

蛋鸡禽致病性大肠杆菌分离鉴定及噬菌体制剂体外杀菌研究

为研究噬菌体制剂对蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗效果,从某蛋鸡养殖场采集疑似禽致病性大肠杆菌感染的病料,进行病原的分离鉴定、生物学特性分析和药物敏感试验等操作,选择其中代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验。结果可见有深紫黑色且带金属光泽细菌生长;镜检可见呈红色两端钝圆的短杆菌;生化鉴定,符合大肠杆菌的生化特性;PCR检测和序列分析结果表明为大肠杆菌。累计从152份样品中分离到大肠杆菌49株,药敏试验结果显示49株分离菌对环丙沙星、阿莫西林、头孢他啶、强力霉素、复方新诺明、林可霉素等耐药率分别高达89.8%、89.8%、93.6%、98.0%、85.7%、100%,临床耐药情况严重。选用5株代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验,与氟苯尼考相比,噬菌体制剂体外杀菌效果更优。复合噬菌体制剂可用于蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗。

大肠埃希氏菌噬菌体swi2裂解系统的表达及协同抑菌活性测定

为了确定大肠埃希氏菌噬菌体swi2裂解系统的穿孔素(holin)与裂解酶(lysin1、lysin2)在裂解宿主菌过程中的协同作用,根据噬菌体swi2裂解系统的基因序列设计引物,搭桥PCR法分别扩增holin-lysin1、holin-lysin2、lysin1-lysin2基因,以pColdTF为载体,构建重组质粒pCold-holin-lysin1、pCold-holin-lysin2、pCold-lysin1-lysin2,在大肠埃希氏菌BL21中诱导表达,并测定各串联蛋白对大肠埃希氏菌BL21的菌内外裂解活性。结果表明,成功构建了噬菌体swi2裂解系统相关基因两两串联的重组质粒,并在原核系统中实现了holin-lysin1、holin-lysin2、lysin1-lysin2蛋白的可溶性表达。lysin1、lysin2具有天然的菌内和菌外裂解活性,而单独的holin未表现出任何抑菌活性;lysin1与lysin2、holin与lysin1之间无协同作用,而holin与lysin2之间存在协同作用,可以显著增强lysin2的菌内外裂解活性(P<0.05)。研究结果证明了lysin1和lysin2在噬菌体swi2增殖后期替代holin完成裂解宿主菌的过程,两者之间不存在协同作用,这将为进一步阐明噬菌体swi2的裂解机制提供参考。

一株鸭源大肠杆菌噬菌体vB_EcoS214的分离鉴定

为分离能裂解鸭源大肠杆菌的噬菌体,采用富集法从鸭场污水中分离噬菌体,透射电镜观察其形态,结果显示,分离到1株噬菌体,电镜显示该噬菌体属长尾病毒科,命名为vB_EcoS214,头部直径约40 nm,尾部长约220 nm,宽约10 nm。该噬菌体有较宽的裂解谱,裂解力较强,可成为噬菌体鸡尾酒制剂的候选噬菌体。能裂解鸭源大肠杆菌噬菌体的成功分离,为鸭源大肠杆菌病的噬菌体疗法提供参考。

大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究

为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融合p ST98-AS质粒的四环素抗性基因和I-Sce I核酸内切酶基因,构建缺失质粒p WRG99。利用质粒p WRG99分别构建大肠杆菌K88的gp52和gp53基因缺失突变株(Δgp52和Δgp53)并经PCR和测序鉴定。利用丝裂霉素C诱导Δgp52和Δgp53,采用双层平板法检测噬菌体的裂解活性,结果显示,Δgp52和Δgp53的诱导液可以在大肠杆菌DE048为宿主菌的平皿上形成清晰的噬菌斑,表明Δgp52和Δgp53能诱导出可以感染DE048的噬菌体(将该噬菌体命名为P88-52和P88-53),并且gp52和gp53基因缺失均不影响噬菌体P88的形成和裂解活性。将P88-52和P88-53纯化并经电镜观察,结果显示,P88-52和P88-53与野生株P88形态相似,具有P2-like噬菌体典型的肌尾和短尾丝特征,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体颗粒的形态。利用P88的宿主菌对P88-52和P88-53进行宿主谱分析,结果显示,P88-52和P88-53在DE048为宿主菌的平皿上均可以形成清晰的噬菌斑,在MC1061、DH5α和BL21为宿主菌的平皿上均不能形成噬菌斑,与噬菌体P88宿主谱相同,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体的宿主谱。综上所述,在宿主菌K88基因组的基础上缺失gp52和gp53基因后,诱导出的P88突变噬菌体的裂解活性和宿主谱均不受影响。本研究通过在宿主菌中对前噬菌体基因编辑来研究溶原性噬菌体的基因功能,为其他溶原性噬菌体基因功能的研究提供了参考依据。

1株大肠杆菌噬菌体vB_EcoP_GN07的分离鉴定及全基因组分析

【目的】探究大肠杆菌噬菌体vB_EcoP_GN07的生物学特性和全基因组特征,为开发噬菌体“鸡尾酒”制剂防治致病性大肠杆菌病提供生物学材料。【方法】采用双层平板法从广西南宁某养鸡场分离到1株大肠杆菌裂解性噬菌体vB_EcoP_GN07;通过透射电镜观察、宿主谱测定、pH和温度稳定性评估、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长曲线测定、全基因组测序等方法了解噬菌体的形态学、生物学特性和全基因组特性。【结果】透射电镜显示,vB_EcoP_GN07头部直径为45 nm±5 nm,尾部长约25 nm,属于短尾噬菌体科,宿主特异性强;在4~60℃可以保持效价稳定,在pH 3.0~11.0可以保持噬菌体活性;该噬菌体的最佳MOI为10-2;一步生长曲线显示该噬菌体潜伏期为60 min,裂解量为560 PFU/cell;测序结果显示其属于双链线型DNA,长度为70120 bp,GC含量为42.8%;噬菌体vB_EcoP_GN07共有81个开放阅读框,其中23个为已知功能蛋白。经BLASTN比对显示,vB_EcoP_GN07与NCBI数据库中其他噬菌体相似性较低,符合N4-like属噬菌体的特点,没有发现与耐药性、毒力因子、毒素和溶源性相关蛋白。【结论】试验成功分离到1株大肠杆菌噬菌体vB_EcoP_GN07,其具有裂解能力强、特异性强、耐酸碱的特点,与其他噬菌体相似性较低,为1株新的N4-like噬菌体。结果可为未来应用大肠杆菌噬菌体vB_EcoP_GN07开发新型杀菌剂提供理论依据。

污水中分离的大肠杆菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体的生物学特性分析

目的以污水中分离的大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage,ECP)和金黄色葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus aureus phage,SAP)作为研究对象,初步分析其生物学特性,为研究噬菌体应用提供新的实验材料。方法采用双层琼脂法纯化ECP和SAP,利用扫描电镜观察形态特征,通过最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)实验、一步生长曲线实验、温度、pH、氯仿及紫外线敏感性实验进行生物学特性分析。结果根据形态将两种噬菌体归为肌尾噬菌体科,最佳MOI均为10^(-1),均对紫外线具有较强的抵抗力。ECP和SAP的潜伏期分别为20 min和10 min,子代噬菌体裂解量分别为76.3 PFU/cell和8.3 PFU/cell。ECP对温度耐受范围较宽,能在30~50℃稳定存活,而SAP对温度较敏感,在50℃的条件下,作用1 h,即可完全失活;ECP在pH为5~11的范围内,SAP在pH为6~9的范围内维持较好的裂解活性;ECP对氯仿具有较强的耐受性,为无囊膜型噬菌体,而SAP对氯仿较敏感,为囊膜型噬菌体。结论ECP和SAP均为烈性噬菌体,对紫外线有较强的抵抗力;ECP的裂解性、对温度、pH及氯仿的耐受性均强于SAP。

影响大肠杆菌噬菌体f_2计数的因素

影响大肠杆菌噬菌体ｆ２计数的因素军事医学科学院卫生学环境医学研究所（天津３０００５０）王新为芮期义高明晁福寰作为人类肠道病毒的指示微生物大肠杆菌噬菌体ｆ２已被广泛应用与研究［１～４］。因其物理、化学性质、颗粒大小以及对外界环境耐力与人类肠道病毒相似［...

浊度对紫外灭活大肠杆菌和MS-2噬菌体的影响

以大肠杆菌和MS-2噬菌体为细菌和病毒的替代指标,考察了浊度及颗粒物分布对紫外线灭活大肠杆菌和MS-2噬菌体的影响。结果表明,紫外线对大肠杆菌的灭活率高于对MS-2噬菌体的灭活率,当紫外线剂量为10 mJ/cm2时,对大肠杆菌的灭活率为4.66个对数级,而对MS-2的灭活率仅为0.45个对数级;浊度对紫外线灭活大肠杆菌的效果有一定的影响,当浊度<4 NTU时对灭活效果的影响较小,而当浊度>4 NTU时,会对灭活效果产生明显的影响;颗粒物对紫外线灭活大肠杆菌的影响与其粒径有关,粒径>5μm的颗粒物对消毒效果的影响较为明显,而粒径<5μm的颗粒对紫外线消毒效果的影响较小。综合不同粒径颗粒物对消毒效果的影响可以认为,就试验水样而言,浊度对紫外线消毒效果的影响主要是由粒径>5μm的颗粒造成的;而浊度及颗粒物的粒径分布对紫外线灭活MS-2噬菌体的效果没有显著影响。

三种消毒剂对大肠杆菌F_2噬菌体灭活效果的实验研究

采用悬液定量试验,观察了次氯酸钠、二氧化氯、二溴海因等3种消毒剂对大肠杆菌F2噬菌体的灭活效果,同时与灭活脊髓灰质炎病毒的效果进行了比较。结果,含有效氯500 mg/L的次氯酸钠消毒液作用15 m in,对F2噬菌体和脊髓灰质炎病毒灭活对数值均>4.0;含二氧化氯200 mg/L和250 mg/L的消毒液作用5 m in,分别对F2噬菌体和脊髓灰质炎病毒的灭活对数值达4.0以上;含有效溴500 mg/L的消毒液作用45 m in,对F2噬菌体灭活对数值>5.0,对脊髓灰质炎病毒的灭活对数值达4.0以上。结论,在相同的试验条件下,F2噬菌体与脊髓灰质炎病毒对所选消毒剂的抵抗力接近,因此可以选择大肠杆菌F2噬菌体作为病毒消毒试验的指示微生物,可明显缩短病毒灭活效果评价周期。

鸡源大肠杆菌噬菌体LHE71的生物学特性和全基因组序列分析

为了获得具有高效广谱裂解特征的噬菌体,本试验以96株鸡源大肠杆菌(E.coli)临床分离株为宿主菌,用双层平板法从鸡场采集的5份粪便样品中分离纯化噬菌体,测定噬菌体的裂解谱,并对筛选到的噬菌体进行形态观察、生物学特性测定和全基因组序列分析。结果显示,从鸡场采集的粪样中分离到1株烈性大肠杆菌噬菌体,命名为LHE71,在菌苔上形成透亮带晕环的噬斑。透射电镜观察该噬菌体形态为长尾噬菌体,正二十面体的头部直径约为70 nm,弯曲的尾部长约150 nm。以E.coli K12为宿主菌增殖噬菌体,当感染复数为0.1时效价最高,可达到2.6×10^(15)PFU/mL;该噬菌体增殖的潜伏期约为40 min,爆发量约为10^(4)PFU/cell。噬菌体LHE71在60℃以下、pH 7~9的范围内活性稳定,对紫外线有一定的抵抗力。噬菌体LHE71基因组全长50158 bp,预测到81个开放阅读框,其中24个编码已知功能蛋白,无tRNA,不含毒力基因和耐药基因。GenBank数据库中共有32株噬菌体与LHE71有同源性,基于噬菌体衣壳蛋白和末端酶大亚基的进化分析结果显示,LHE71为Tunavirus属噬菌体。结果表明,本试验从鸡场粪样中成功分离并鉴定1株高效宽裂解谱噬菌体LHE71,具有良好的生物学特性,为进一步开发为噬菌体制剂防控鸡源大肠杆菌病提供了基础。