产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗在小鼠中的免疫原性

目的观察肠毒素大肠杆菌(ETEC)基因工程疫苗的抗原性效果,筛选有效的防治ETEC腹泻病基因工程疫苗株。方法将表达ETEC抗原成分的重组质粒pZCF16和pZHY22分别转化入载体痢疾福氏2a菌株FWL01中,构成含不同ETEC抗原成分的工程疫苗株FE3和FE16。分别用FE3与FE16活菌和灭活菌制成的疫苗以同等剂量梯度,通过口服和鼻饲途径免疫小白鼠,经过一定时间检测2组小白鼠的免疫效果。结果在免疫后的小白鼠血液中均产生了特异性抗IgG抗体,在活菌免疫组肠道内也产生了特异性分泌型抗体IgA;抗体IgG 1周后开始升高,且在8周后达到高峰。抗体IgA的产生规律与IgG相似。结论肠毒素大肠杆菌载体菌苗FE3和FE16有较强的免疫原性,作为多价疫苗的构建是有效的,从而为ETEC腹泻的特异性免疫防治提供了可能。

生长抑素(SS)大肠杆菌基因工程疫苗促进小尾寒羊生长的试验研究

对山东小尾寒羊进行了SS大肠杆菌基因工程疫苗的免疫增重试验 ,结果显示 :免疫母羔羊5 8天比载体对照组提高增重 15 6 4% (P <0 0 1) ,90天提高增重 2 8 2 % (P <0 0 1) ;免疫公羔羊变化不明显。

基于基因组重测序的高产尿苷大肠杆菌工程菌株的构建

以大肠杆菌高产胞苷E.coli XD10为出发菌株,首先对其进行基因组重测序,分析其相较于野生型菌株的尿苷合成及降解相关基因变化情况。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过依次构建T7 RNA聚合酶基因T7 gene 1、使用异源T7启动子的催化胞苷向尿苷转化的胞苷脱氨酶基因cdd以及催化尿苷降解的核苷酸-5′磷酸核苷酶基因ppnN的敲除质粒及其同源修复供体DNA片段,将敲除质粒及相应同源修复供体共转化大肠杆菌感受态细胞,PCR和测序验证正确的转化子进行打靶质粒和pCas质粒的消除,获得基因编辑大肠杆菌工程菌株E.coli URI-1、URI-2和URI-3。半定量PCR实验结果表明,染色体敲入的T7 gene 1和cdd基因在工程菌株中均进行了有效表达。使用T7转录系统过表达cdd基因的URI-2菌株摇瓶发酵产物的HPLC检测结果显示,其发酵液中尿苷产量为8.32 g/L,而出发菌株XD10发酵液尿苷产量为0.80 g/L。进一步敲除ppnN基因的工程菌株URI-3发酵液尿苷HPLC检测产量为10.76 g/L,显著高于URI-2发酵液尿苷产量(P<0.05)。本研究获得的高产尿苷大肠杆菌工程菌株,为尿苷的工业化发酵生产提供了菌种保障。

产肠毒素大肠杆菌四价基因工程灭活疫苗研制

目的利用PCR和基因定点突变技术,分别扩增出K88ac、K99、LTB和突变的ST1基因,构建了重组菌株BL21(DE3)(pXKKSL4),酶切鉴定和序列分析表明构建的pXKKSL4表达载体包含有K88ac-K99-3ST1-LTB融合基因且阅读框架正确。方法SDS-PAGE分析表明融合蛋白占菌体总蛋白含量的35.72%。ELISA检测证实融合蛋白能与ST1单抗、LTB、K88ac和K99抗体相结合。结果乳鼠灌胃实验表明K88ac-K99-3ST1-LTB融合蛋白已失去ST1天然毒性,免疫保护试验表明菌株氢氧化铝佐剂苗和包涵体粗提物氢氧化铝佐剂苗均具有良好的免疫效果,其免疫保护率分为98%和96%。结论上述研究表明构建的四价灭活疫苗不但解决了ST1肠毒素毒性问题,而且又赋予其免疫原性,同时增加K99菌毛可使免疫效果进一步增强,这样从肠毒素和菌毛两种途径,达到预防由ETEC引起的腹泻目的,从而有效控制腹泻的发生,为将来制备产肠毒素大肠杆菌基因工程灭活疫苗打下坚实基础。

我国马流感病毒分子生物学诊断方法及基因工程疫苗的研究进展

马流感(Equine influenza,EI)是由马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)引起马属动物的一种高度传染性疾病,给全球马属动物产业造成重大经济损失。本文论述了我国马流感病毒分子生物学诊断方法,包括常规PCR方法、荧光PCR方法、环介导等温扩增技术等,并就其基因工程疫苗研究进行了着重阐述,以期为该病的诊断和防控提供参考。

产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性

目的观察产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)基因工程疫苗在SD大鼠中的免疫原性。方法将含ETEC抗原成分热不稳定肠毒素B亚单位(Heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB)的双歧杆菌疫苗给SD大鼠灌胃4次,同时设对照组,以PBS平行灌胃。采用ELISA法检测大鼠粪便上清液IgA及血清IgG抗体水平;免疫组化法检测大鼠空肠中sIgA抗体的表达;肠绊试验检测肠毒素的活性。结果免疫疫苗的SD大鼠粪便上清液中产生了IgA抗体,血清中产生了特异性的IgG抗体,肠道内产生了特异性分泌型sIgA抗体;免疫组化结果显示,随着免疫次数的增加,抗体分泌量明显增加;双歧杆菌疫苗免疫的大鼠能够抵抗LT抗原的侵袭,而对照组大鼠则出现明显的肠道积液现象。结论构建的双歧杆菌疫苗具有良好的免疫效果,可保护SD大鼠免受ETEC的感染。

人产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗的研究进展

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起腹泻的主要致病菌之一,在世界范围内,每年可导致数亿人发生腹泻,尤其是发展中国家的婴幼儿和儿童。目前,世界各国通过构建新型的ETEC基因工程疫苗预防ETEC引起的腹泻。将ETEC的肠毒素基因和菌毛蛋白基因转化至无毒的受体菌中,构建出基因工程疫苗,免疫人体后可有效预防ETEC引起的腹泻。本文就ETEC的致病机理及国内外ETEC基因工程疫苗的最新研究进展作一综述。

恶性疟基因工程疫苗的研究Ⅲ．恶性疟原虫保护性抗原复合基因在大肠杆菌中的表达及产物分析

将人工合成的恶性疟原虫保护性抗原复合基因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＢＶ２２０重组并转化大肠杆菌ＤＨ５χ，挑取工程菌进行发酵试验并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物。结果显示经温度诱导后的工程菌在相当于分子量１０ｋｄ和２５ｋｄ的位置出现表达产物的条带，扫描测定表达产物的量占菌体蛋白总量的５％左右。免疫印迹分析显示表达产物可与免抗恶性疟原虫多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示表达产物为具有恶性疟原虫抗原位点活性的重组复合蛋白。

肠产毒性大肠杆菌分子生物学及基因工程疫苗的研究进展

综述了肠产毒性大肠杆菌(ETEC)的分子生物学和基因工程疫苗的最新进展。ETEC的肠毒素基因和菌毛蛋白基因对于ETEC的致病性起主要作用,肠毒素基因工程疫苗为预防ETEC引起的腹泻开辟了新的途径。

病毒类基因工程疫苗研究进展

疫苗接种被认为是控制病原体和预防人类以及动物疾病最有效的方法之一.近年来由于病毒性疾病来势汹汹,传统疫苗如灭活或减毒活疫苗的局限性及潜在问题日益突显,而基因工程技术的进步使得疫苗设计和研发得以改进,由此衍生的病毒类基因工程疫苗作为下一代疫苗越来越受到研究者的高度关注.通过病毒类基因工程疫苗的类型,重点介绍不同疫苗的开发原理、特点及用途,探讨其应用前景和发展趋势,旨在为新发病毒类疾病疫苗的研发提供参考.

基因工程疫苗在动物疾病防治中的前景

随着生物科技的不断革新,动物疫病的防治手段也越来越多,但在兽医临床当中,疫苗仍然是重要的防护手段。传统疫苗的研制受到微生物体外培养以及安全性等多方面的限制,在使用中存在着较大的风险,而随着现代生物技术和手段的发展,利用基因工程技术研发的疫苗,具有更高的安全性和稳定性,同时还具备大批量生产的可能性,进一步降低了生产的成本,是未来动物疾病防治的主流发展趋势。本文对基因工程疫苗进行了简单的阐述,同时分析了基因工程疫苗所具有的优势和劣势,以及当前的应用现状,并就此分析了其在动物疾病防治当中的发展前景,以供相关人士参考。

仔猪大肠杆菌K_(88)-ST_1-LT_B三价基因工程灭活疫苗的应用实验

对妊娠14－16周母猪颈部肌肉注射仔猪大肠杆菌K88－ST1－LTB三价基因工程灭活疫苗（以下简称三价灭活苗）的结果表明：三价灭活苗可以大大降低仔猪大肠杆菌的发病率和死亡率，差异极显著（P＜0．01）；对仔猪生长安全、无副作用；三价灭活苗的使用效果明显优于仔猪大肠杆菌K88－K99双价基因工程灭活疫苗（以下简称双价灭活苗）；疫苗现场应用免疫保护率明显高于双价灭活苗，差异极显著（P＜0．01）。

基因工程疫苗在畜禽疫病防制中的应用

随着现代生物科技的发展,基因工程疫苗在畜禽疫病防制领域发挥着重要的意义。与传统疫苗相比,基因工程疫苗具有更高的安全性、稳定性和免疫效果好的特性,被广泛应用于畜禽疫病防制中。本文主要论述基因工程亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺失疫苗和核酸(DNA)疫苗在疫病防制中的具体应用,以期为我国畜牧业的健康发展提供有益的参考和借鉴。

种猪繁育与育肥场猪瘟E2基因工程疫苗免疫效果的调查与研究

为探究猪瘟E2基因工程亚单位疫苗相比于传统猪瘟C株弱毒疫苗(脾淋源)在免疫与生产上的优势,本文以汉中某一地方品种种猪场和代养场为调查对象,选择一批繁育母猪和育肥仔猪分别免疫猪瘟E2基因工程亚单位疫苗和猪瘟活苗,对比结果发现,母猪免疫猪瘟E2亚单位疫苗后哺乳仔猪断奶成活率平均提高了16.3%;且接种的两种猪瘟疫苗对育肥仔猪的免疫效果差异极显著(P<0.01),其中E2亚单位疫苗相比于猪瘟活疫苗能够明显提高育肥仔猪抗体阻断率和降低离散度,有助于育肥仔猪的健康生长,这为规模化猪场在选择猪瘟疫苗时提供重要参考依据。

基因工程疫苗在动物疫病防控中的应用现状

基因工程作为一种先进的疫苗研发技术,在动物疫病防治中具有重要意义。本文综述了基因工程疫苗在动物疫病防治中的应用现状,包括亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等类型,并针对现有问题提出了相应的对策,为我国动物疫病防治提供科学依据。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1(DE3) (pXKST3LT5 )。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄。

基因敲除提高大肠杆菌工程菌生产异丁醇产量的研究

探究pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株对大肠杆菌工程菌发酵生产异丁醇的影响。运用Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113的pflB、frdAB、fnr和AdhE基因,构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株E.coliBW25113H,结合本实验室已经构建的表达质粒pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA,并检测该工程菌在1L发酵罐的发酵过程中的生物量、突变菌株的稳定性、异丁醇产量及有机酸含量的变化情况。成功获得pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H。发酵结果表明,该工程菌能以较长时间,较高比生长速率保持对数生长期,其稳定性较好,异丁醇产量增加了40%。成功构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H,结合非自身发酵途径使异丁醇的产量由3 g/L提升至4.2 g/L。

大肠杆菌二硫键形成相关蛋白的结构、功能及其在基因工程表达外源蛋白上的应用

大肠杆菌分泌蛋白二硫键的形成是一系列蛋白协同作用的结果 ,主要是Dsb家族蛋白 ,迄今为止共发现了DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、DsbE和DsbG。在体内 ,DsbA负责氧化两个巯基形成二硫键 ,DsbB则负责DsbA的再氧化。DsbC和DsbG负责校正DsbA导入的异常二硫键 ,DsbD则负责对DsbC和DsbG进行再还原 ,DsbE的功能与DsbD类似。除了直接和二硫键的形成相关外 ,DsbA、DsbC和DsbG都有分子伴侣功能。它们的分子伴侣功能独立于二硫键形成酶的活性并且对二硫键形成酶活性具有明显的促进作用。基于Dsb蛋白的功能特性 ,利用它们以大肠杆菌为宿主表达外源蛋白 ,特别是含有二硫键的蛋白 ,取得了很多成功的例子。本文简要介绍了这方面的进展 。

高密度培养基因工程大肠杆菌生产α-乙酰乳酸脱羧酶

在 30 0 0 L 发酵罐中 ,利用分批补料培养技术高密度培养含分泌型重组质粒 p ETGAU- 10的大肠杆菌TG1,生产α-乙酰乳酸脱羧酶。通过控制发酵条件 ,发酵液的细胞密度 (OD60 0 )可达 30 .5 ,且胞外α-乙酰乳酸脱羧酶活力最高达 890 U .ml- 1 ,达到较为理想的工业化生产的要求。