氧化还原对铁结合的大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ活性的调控

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(E.coli TopA)属于I型拓扑异构酶,在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程中发挥关键作用。E.coli TopA不仅能结合锌,还可以结合铁。细胞内过量铁可与锌竞争,通过与锌指结构域结合减弱其DNA结合能力和改变蛋白质空间构象,从而抑制TopA拓扑异构酶活性。然而,铁结合形式TopA的氧化还原特性以及氧化还原条件对其活性的影响仍不清楚。本研究通过紫外分光光谱和体外DNA拓扑异构酶活性分析,发现体外纯化得到的铁结合形式的TopA呈氧化状态,能够被二硫苏糖醇和连二亚硫酸钠还原,原本氧化状态下无活性的TopA在还原条件下,可恢复其拓扑异构酶活性。当还原剂被去除后,铁结合的TopA在空气中能够重新被氧化,且其活性重新受到抑制。这说明,氧化还原条件对铁结合的TopA功能具有可逆调节作用。通过金属-蛋白体外结合实验进一步发现,无金属结合的TopA蛋白(apo-TopA)在无氧条件下,与Fe^(2+)和Fe^(3+)均能结合,但与Fe^(2+)结合能力较弱,并且TopA结合的Fe^(3+)被还原成Fe^(2+)后,结合力显著下降,能够被铁螯合指示剂菲咯嗪快速捕获。此外,蛋白质内源性荧光光谱分析实验表明,铁结合的TopA在氧化还原的不同状态时,其在330 nm左右的荧光值有显著差异。这提示,氧化还原条件可能通过影响铁离子与TopA的结合状态,引起蛋白质空间构象改变,从而对TopA的拓扑异构酶活性进行调节。此研究表明,铁结合TopA的拓扑异构酶活性会受到细胞内氧化还原信号的可逆调控,也提示I型拓扑异构酶可能是细胞铁超载通过氧化损伤引起细胞功能障碍(或铁死亡)的靶点之一。

金属抗菌肽SIF_(4)对大肠杆菌拓扑异构酶活性及胞内核酸合成的影响

为系统阐明金属抗菌肽SIF_(4)基于DNA拓扑异构酶靶点的非细胞质膜抑菌机理,以大肠杆菌为模式菌株,研究了金属抗菌肽SIF_(4)与基因组DNA的结合方式、对DNA拓扑异构酶I/II活性以及胞内核酸生物合成的影响机理。研究发现,金属抗菌肽SIF_(4)可能以类似溴化乙锭嵌插方式与基因组DNA结合,对拓扑异构酶I有较强抑制活性,但对拓扑异构酶II影响较小,可通过影响DNA负超螺旋解链和RNA聚合酶结合催化RNA转录过程发挥抑菌活性。研究还发现,经金属抗菌肽SIF_(4)处理12 h后,大肠杆菌胞内总DNA和总RNA生物合成量均受到不同程度的抑制,且呈现良好的量-效关系,1/2最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)组与对照组(0 MIC)相比,胞内DNA和RNA生物量差异不显著(P>0.05),MIC和2 MIC组与对照组相比,胞内DNA和RNA生物量差异显著(P<0.05)。实验结果可为金抗肽SIF_(4)在食源性大肠杆菌生物防控中的应用提供理论支持。

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ结合重金属的特性及功能影响

【背景】大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ(Escherichia coli topoisomerase I,E.coli TopA)在DNA复制、转录、重组和基因表达调控等过程发挥关键作用。研究表明E.coli TopA只有结合锌离子才具有活性,然而E.coli TopA能否结合其他金属离子尤其是重金属离子,以及结合其他金属后是否具有活性,目前仍不清楚。【目的】探究大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ是否结合环境中常见重金属离子,研究重金属离子结合E.coli TopA蛋白后对其活性的影响。【方法】在分别添加有锌、钴、镍、镉、铁、汞、砷、铬、铅、铜离子的M9基础培养中表达、纯化出E.coli TopA蛋白,并对纯化得到的蛋白用电感耦合等离子体质谱仪进行相应金属离子含量的测定;利用表达E.coli TopA锌指结构的突变体蛋白鉴定重金属离子的结合位点;通过体外超螺旋DNA松弛实验测定不同金属结合E.coli TopA的拓扑异构酶活性;通过测定蛋白内源性荧光推测不同金属结合E.coli TopA的空间构象差异。【结果】E.coli TopA在体内除了能结合锌和铁之外,还能够结合钴、镍、镉3种离子,但是不能结合汞、砷、铬、铅、铜离子。钴、镍、镉结合形式的E.coli TopA,每个蛋白分子最多可以结合3个相应的金属离子,他们与TopA蛋白的结合位点也是位于3个锌指结构域,而且每个锌指结构域结合1个金属离子。此外,E.coli TopA结合钴、镍、镉离子后,其DNA拓扑异构酶活性并未受到影响,可能是由于钴、镍、镉离子结合形式的E.coli TopA蛋白,其空间构象与锌结合形式相比并未发生显著变化。【结论】由于DNA拓扑异构酶在维持细胞正常生理功能中发挥关键作用,研究表明E.coli TopA的功能不会受到常见重金属的干扰(不结合或者结合后活性无影响),这也有可能是大肠杆菌在进化过程中产生的对抗环境中重金属离子毒害作用的一种自我保护和耐受机制,具有重要的生理意义。

DNA拓扑异构酶Ⅰ结构、功能及喜树碱类抗癌药物研究进展

目的 DNA拓扑异构酶I是生物体内极其重要的细胞核内酶 ,参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的核内过程。该酶已成为重要的抗癌药物研究新靶点。讨论了该酶迄今最特异性抑制剂喜树碱类化合物研究近况。方法 以近年来国外发表的论文为基础 ,介绍拓扑异构酶Ⅰ结构、功能研究的最新成果 ,特别是药物作用模式研究方面的研究成果。结果与结论 这将为新型抑制剂的合理药物设计打下坚实基础。

以重组人DNA拓扑异构酶Ⅰ为靶位从天然产物及其衍生物中筛选抗肿瘤化合物

为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopoⅠ)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,首次使用毕赤酵母表达了hTopoⅠ。在微量反应体系中,测定了化合物抑制hTopoⅠ松驰活性的能力,并用MTT实验验证筛选到的hTopoⅠ抑制剂的抗肿瘤活性。从74个结构新颖的天然产物及人工合成的黄酮类衍生物中筛到6个hTopoⅠ抑制剂,有4个化合物抑制肿瘤细胞生长的能力较强。

拓扑异构酶Ⅰ在人病理性瘢痕组织中的表达分析

背景：有研究表明，DNA拓扑异构酶Ⅰ（TopoⅠ）在多种肿瘤细胞内的含量明显高于正常组织。目的：通过免疫组织化学染色方法比较病理性瘢痕与正常皮肤组织中DNA拓扑异构酶Ⅰ差异。设计、时间及地点：对比观察，于2005-01/2007-12在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。材料：人病理性瘢痕组织标本来同期南昌大学第一附属医院手术切取的人病理性瘢痕组织21例，男15例，女6例；同一患者手术多余的正常皮肤组织标本21例作为对照。方法：对人病理性瘢痕和正常皮肤进行苏木精-伊红染色，鉴定是否为病理性瘢痕和正常皮肤；以免疫组织化学染色检测DNA拓扑异构酶Ⅰ在角质形成细胞和成纤维细胞中的表达。按拓扑异构酶Ⅰ染色阳性细胞占全部细胞的百分比分4个等级：≤5%为阴性（－）；6%~24%为弱阳性（＋）；25%~49%为阳性（＋＋）；≥50%为强阳性（＋＋＋）。主要观察指标：人病理性瘢痕和正常皮肤标本拓扑异构酶Ⅰ在角质形成细胞和成纤维细胞中的表达。结果：拓扑异构酶Ⅰ在人病理性瘢痕和正常皮肤组织的角质形成细胞，成纤维细胞中均有表达。正常皮肤中，角质形成细胞及成纤维细胞各有3例免疫组织化学阳性；病理性瘢痕组织中，角质形成细胞及成纤维细胞各有7例和12例呈阳性。正常皮肤角质形成细胞拓扑异构酶Ⅰ阳性表达率为14.3%，病理性瘢痕组织表达率为33.3%，差异无明显不同（P=0.147 3）；正常皮肤成纤维细胞拓扑异构酶Ⅰ阳性表达率为14.3%，病理性瘢痕阳性总表达率为57.1%，存在明显差异（P=0.003 8）。结论：在病理性瘢痕组织成纤维细胞中，拓扑异构酶Ⅰ的表达明显高于正常皮肤成纤维细胞。

鸭源大肠杆菌对氟喹诺酮类耐药机制的研究

目的:分析鸭源大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药机制。方法:微量肉汤稀释法测定4种喹诺酮类药物对22株鸭源大肠杆菌分离菌及恩诺沙星诱导耐药菌的抗菌活性,并通过PCR和DNA测序检测DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ基因(gyrA、gyrB、parC、parE)突变情况。结果:22株分离菌及诱导菌均扩增出目的片段,有18株菌对喹诺酮类药物耐药,耐药率约为82%。基因测序及分析表明:在9个测序菌株中,分别有5、2、6和7株出现gyrA、gyrB、parC和parE碱基突变;其中,gyrA基因突变,gyrB与parC或parE基因同时突变与耐药表型一致,3株仅有parC或parE基因突变的菌株并不明显耐药。gyrA基因突变均为双突变(Ser104→Leu和Asp108→Asn)。结论:鸭大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药严重,其主要机制是喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的基因突变,特别是多个位点同时突变导致高水平耐药。

DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制药——抗肿瘤药喜树碱类衍生物的研究进展

目的 :DNA拓扑异构酶Ⅰ是生物体内及其重要的细胞核内酶 ,参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的核内过程。该酶已成为重要的抗肿瘤药物研究新靶点。讨论了该酶特异性抑制剂喜树碱类衍生物研究进展。方法 :以近年来国内外发表的论文为基础 ,介绍拓扑异构酶I结构、功能研究的最新成果。系统总结了喜树碱类衍生物的构效关系 ,依据构效关系介绍了最新的结构修饰而得衍生物。结果与结论 :将为新型DNA拓扑异构酶I抑制剂的合理药物设计打下一定的基础。

高喜树碱——极具开发价值的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂

拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)是细胞生存的必需酶，多种肿瘤细胞中TopoⅠ的含量远高于正常细胞，拓扑异构酶Ⅰ抑制剂已成为高选择性抗肿瘤药物研究的一个主攻方向。喜树碱类化合物是最重要的TopoⅠ抑制剂，也是世界抗肿瘤药物研究的热点之一。

两株高DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制活性的药用植物内生真菌筛选

从7种中国南方药用植物中分离了278株内生真菌,分析了其发酵液甲醇提取物对人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTo-poI)松驰活性的抑制能力。对2株具有高hTopoI抑制力的内生真菌(LF4-7L和LF6-1)进行了深入研究。通过发酵物对hTo-poI抑制能力的时间变化曲线,表明2株内生真菌的hTopoI抑制物质在其生长停滞阶段才大量产生和积累。经分子鉴定,LF4-7L可能是阴炭团菌(Hypoxylon stygium),而与LF6-1L最相近的是毛竹基腐病菌(Arthrinium phaeospermum)。

拓扑异构酶Ⅰ抑制剂研究进展

拓扑异构酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ,TopoⅠ)是抗肿瘤研究的重要靶点,以TopoⅠ为靶点的药物在肿瘤化疗中被广泛应用。目前临床使用或处于临床前研究的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂主要分为喜树碱类(camptothecin,CPT)和非喜树碱类(non-camptothecin TopoⅠinhibitor)化合物。本文主要介绍了近年来TopoⅠ抑制剂研发领域的最新进展和发展趋势,并重点就近年来涌现出的一些新的TopoⅠ抑制剂的抗肿瘤活性和药理学特性做一综述。

喜树中两个DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂(英文)

目的以生物活性为向导在喜树中寻找天然的DNA拓扑异构酶I抑制剂。方法用各种层析方法和波谱方法从喜树中分离并鉴定了14个化合物。结果其结构分别鉴定为喜树碱(1),肌醇(2),喜果苷(3),3′甲基3,4O,O亚甲基鞣花酸4′OβD吡喃葡萄糖苷(4),2氧1,2二氢喹啉4酸(5),马钱子酸(6),4甲基1,2环己烷二甲醇(7),strictosamide(8),獐芽菜苷(9),乙酰胺(10),氯原酸(11),strictosidinicacid(12),1咖啡酰基奎宁酸(13)和10羟基喜树碱(14)。结论化合物413为首次从该植物中分得,化合物4的核磁数据在文献[5]中有误,本文对其进行了重新归属。经体外活性测试,化合物1对DNA拓扑异构酶Ⅰ有中等程度的抑制作用,化合物4,14对DNA拓扑异构酶I有强的抑制作用。

拓扑替康对鼻咽癌体外放射后拓扑异构酶Ⅰ基因mRNA表达水平的变化

【目的】观察拓扑替康对鼻咽癌体外放射后拓扑异构酶Ⅰ基因mRNA表达水平的变化,初步探讨拓扑替康对鼻咽癌体外放射增敏作用的分子水平机制。【方法】应用实时荧光定量RT-PCR技术检测人鼻咽癌高分化细胞系(CNE-I)经照射及照射加拓扑替康(topotecan)后其中拓扑异构酶I(topoisomerase I,TOPO-I)基因mRNA表达水平。【结果】单纯照射组在1、2、3、4、6、8、10Gy剂量下TOPO-I基因mRNA水平(copies/μl)分别为152566±1.3、16694±1.1、11770±1.1、2112±1.2、1699±1.3、2.98±1.0、1.69+1.1,较对照组差异具有统计学意义(P<0.01);照射加药组在相同剂量下其mRNA水平(copies/μl)分别为35150±1.1、4578±1.1、2795±1.2、403±1.9、45±2.1、2.87±1.1、1.53±1.0.较对照组差异也具有统计学意义(P<0.01);1、2、3、4、6 Gy剂量下,照射加药组较单纯照射组差异具有统计学意义(P<0.05);而8、10 Gy剂量下,该差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】在低照射剂量下,拓扑替康可能通过降低CNE-I细胞中TOPO-I基因表达水平来达到放射增敏作用。

拓扑异构酶Ⅰ抑制剂研究进展

拓扑异构酶Ⅰ(topoisomerase,Topo)参与DNA复制、转录、重组、修复等所有关键的细胞核内过程,是抗肿瘤研究的重要靶点,以TopoⅠ为靶点的药物在肿瘤化疗中被广泛应用。目前临床使用或处于临床前研究的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂主要分为喜树碱类和非喜树碱类化合物。该文主要介绍了近年来TopoⅠ抑制剂研发领域的最新进展和发展趋势,并就近年来涌现出的一些新的TopoⅠ抑制剂的抗肿瘤活性和药理学特性做一总结。

大肠杆菌topA-菌株中质粒pBR322的超凝集结构

超凝集DNA是质粒DNA的一种特殊拓扑结构形式,最初在大肠杆菌SD108(topA+gyrB225)细胞中被发现.现在大肠杆菌DM800(topA-gyrB225)细胞中也发现了这种结构,这说明超凝集DNA的形成与细胞内旋转酶活性降低有直接关系,而与拓扑异构酶Ⅰ的存在与否无关.体外实验的结果显示,具有很强的正超螺旋松弛活性的拓扑异构酶Ⅳ可以将超凝集DNA完全松弛,这也证明质粒DNA的超凝集结构与超螺旋结构在细胞内是可以互变的.使用原子力显微镜对分离到的pBR322DNA超凝集结构进行分析,并与普通超螺旋进行比较,结果表明,超凝集DNA分子的结构发生了巨大的变化,其分子长度比正常超螺旋分子缩短了约30%,宽度和高度则增加了60%,结构更接近于A型DNA.另外,原子力显微镜研究结果表明,氯喹的嵌入并非改变了超凝集DNA的超螺旋状态,而是使其打结并最终压缩成一团.

磷酸吡哆醛对H22肝癌细胞DNA拓扑异构酶Ⅰ活性的影响

为建立DNA拓扑异构酶活性测定方法和探讨磷酸吡哆醛(PLP)抑制肿瘤细胞增殖的可能机制,本实验以DNA琼脂糖凝胶电泳EB荧光法测定了H22肝癌细胞DNA拓扑异构酶I(TOPOI)的活性。结果表明维生素B6的活性形式PLP能有效地抑制TOPOI松弛负超螺旋的作用,且抑制效应与PLP剂量呈正相关。从而证实PLP能明显抑制TOPOI的活性并在分子水平上调节细胞周期活动和肿瘤细胞增殖活动。

DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂研究进展

DNA拓扑异构酶Ⅰ (TopoⅠ )参与DNA复制、转录、重组、修复等所有关键的细胞核内过程 ,已成为极其重要的抗癌药物研究新靶点。目前 ,美国国立癌症研究所药物机制分析电脑网络系统已将TopoⅠ抑制剂列为重点研究的六大类抗肿瘤药物之一。近年来 ,TopoⅠ抑制剂研究出现了新的高潮 ,已有数个喜树碱类化合物进入临床研究 ,还发现了一些结构新颖、活性较好的非喜树碱类TopoⅠ抑制剂。本文简单介绍TopoⅠ的拓扑结构与活性位点 。

肿瘤细胞对DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂的耐药研究进展

DNA拓扑异构酶(Topo)抑制剂作为一种新的抗癌靶点,在恶性肿瘤的治疗中有广阔的应用前景,然而耐药性的出现极大限制了其临床应用。Topo分Ⅰ,Ⅱ两型,就Topo Ⅰ抑制剂的耐药机理及可能的逆转途径进行综述。

鼻咽癌组织中拓扑异构酶Ⅰ的表达

【目的】探讨鼻咽癌组织中拓扑异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ)的表达及其意义。【方法】LSAB 免疫组化法检测60例鼻咽癌患者鼻咽活检病理切片肿瘤组织中 Topo Ⅰ的表达,并结合肿瘤临床病理特征、预后进行分析。【结果】Topo Ⅰ在鼻咽癌组织中表达的百分数从0～90%不等,平均50.4%±32.4%,以大于或等于50%的癌细胞表达 Topo Ⅰ为高表达的判断标准,则高表达率为56.7%(34/60)。不同性别、年龄组、T 分期、N 分期、临床分期的肿瘤患者 Topo Ⅰ的表达无显著性差异(P>0.05)。生存分析显示,Topo Ⅰ低表达组患者3年无复发生存率、总生存率高于高表达组(P<0.05)。【结论】鼻咽癌组织中存在Topo Ⅰ的高表达,Topo Ⅰ阳性的患者预后差,提示应用 Topo Ⅰ抑制剂治疗可能可以改善 Topo Ⅰ高表达患者的预后。

玉米DNA拓扑异构酶Ⅰ基因片段的克隆

采用同源克隆结合cDNA末端快速扩增反应策略,对玉米DNA拓扑异构酶基因Top1片段进行克隆。结果表明:所克隆基因片段编码的氨基酸序列与水稻DNA拓扑异构酶序列具有较高的相似性。Top1在玉米胚乳中表达量最高,在玉米其他组织中也有表达。对玉米自交系1145 BAC文库进行筛选,获得了Top1基因的阳性BAC克隆。