大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_(1b)基因的亚克隆、重组及其核苷酸序列分析

产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）是幼畜、婴幼儿及旅游者腹泻的重要病原菌之一。作者以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST1b基因。该基因片段扩增物（150bp）经适当方法纯化,与克隆载体pUC18的HlincⅡ位点平端连接,转化到受体菌JM101中。

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展

大肠杆菌的耐热性肠毒素 (ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色 ,对人类和家畜的健康构成很大的威胁 .文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征 ,全面概述了ST的分子生物学研究进展 ,对于从分子水平全面了解ST的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义 .

大肠杆菌耐热性肠毒素的研究进展

随着分子生物学的发展 ,近年来 ,对大肠杆菌耐热性肠毒素的研究已从细胞水平 ,分子水平进入基因水平 ,在其分子结构与功能、理化特性、提纯方法与鉴定、致病机理、分子生物学等方面进行了大量的研究 ,本文就大肠杆菌耐热性肠毒素的研究概况作一简要的介绍。

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白基因工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆茵耐热性肠毒素１（ＳＴ＿１）－β－半乳糖苷酶融合蛋白基因工程菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ＿１）经轧鼠灌胃试验证实没有毒性反应。采用超声波粉碎法裂解菌体，再辅以氢氧化铝胶制冬抗原，免疫接种ＢＡＬＢ／ｃ鼠，获得抗融合蛋白抗体，乳鼠灌胃中和试验结果表明，该抗体能中和天然ＳＴ＿１肠毒素活性，具有较好的免疫保护作用。以该菌株免疫的雌性ＥＡＬＢ／ｃ鼠产下的乳鼠吮吸初乳后，能够抵抗１个鼠活性单位ＳＴ＿１肠毒素的攻击。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ＿１）工程菌株可作为预防大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的侯选菌株。

大肠杆菌耐热性肠毒素（ST）分子生物学研究进展

大肠杆菌耐热性肠毒素（ＳＴ）分子生物学研究进展许崇波，冯书章（吉林长春解放军农牧大学军事兽医研究所，１３００１２）大肠杆菌耐热性肠毒素（５Ｔ）为１８或１９个氨基酸的小肽，免疫原性极差，１００℃加热３０分钟仍保持其活性。ＳＴ可激活小肠上皮细胞内鸟苷酸环...

抗大肠杆菌耐热性肠毒素ST1 McAb杂交瘤细胞系的建立及应用

目的耐热性肠毒素ST1单克隆抗体制备及在感染性腹泻诊断中的应用。方法应用基因工程菌株分泌的肠毒素制备ST1包涵体,免疫Balb/c小鼠,成功制备了3株特异性抗ST1的单克隆抗体细胞株,用其中1株McAb建立了检测ST1的双单克隆抗体夹心ELISA法。结果检测52株从临床腹泻病人粪便中分离的大肠杆菌,检出ST1阳性率为26.92%,与ST1检测的经典方法乳鼠灌胃法符合率为96.15%。结论该方法是一种简捷、灵敏和特异的检测方法,具有实际应用价值。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达

采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(STⅠ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将STⅠ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达载体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白菌株的构建

将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴⅠ）结构基因的质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍｍＨⅠ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＳＴⅠ基因片段，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨⅠ消化、碱性磷酸酶处理，然后将处理的ｐＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴⅠＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＤＨ５α。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴⅠ基因探针杂交阳性的菌株。杂文阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后，经限制性内切酶分析和ＤＮＡ序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴⅠ含有２个连接在一起的ＳＴⅠ基因片段，其连接方向是正向的，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴⅠ）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上呈蓝色菌落．表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ－β－半乳糖苷酶融合蛋白。

表达大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

对已构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行了核苷酸序列分析和免疫原性研究。序列分析结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫实验结果表明，构建的ＤＨ５α（ＰＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然ＳＴ１肠毒素活性，具有较好的免疫保护作用。这表明ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）工程菌株可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1－LacZ融合基因的构建

利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１基因的质粒ｐＢＳＴ２－６和含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８，构建成ＳＴ１－ＬａｃＺ融合基因。将质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＤＮＡ片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ消化、碱性磷酸酶处理，最后将处理好的ｐＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴ１ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＤＨ５ａ中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴ１基因探针杂交阳性的菌落。菌落原位杂交阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后，经限制性内切酶（ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ和ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）酶切分析和ＤＮＡ序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有ＳＴ１基因，而且ＳＴ１基因在重组ＤＮＡ中连接方向是正确的，具有正确的阅读框架。再者，ＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ１）菌株能在含ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１－β－半乳糖苷酶融合蛋白。ＳＴ１－ＬａｃＺ融合基因的构建，为研究ＳＴ的免疫原性和抗ＳＴ抗体在预防产肠毒素性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）感染中的作用?

大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的检测

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是通过产生肠毒素而致婴幼儿、旅游者及幼畜腹泻的,临床检测表明,到发展中国家旅游者中的急性腹泻,至少有1/3～1/2是ETEC引起的。ETEC能产生两种肠毒素:热敏性肠毒素(Heat-Labile Enterotoxin,LT),为大分子具有免疫原性毒素,其作用机理、理化住质以及免疫学特性和检测方法均与霍乱毒素(CT)相似;耐热性肠毒素(Heat-Stable Enterotoxin,ST)。

大肠杆菌耐热性肠毒素的特性及检测

大肠杆菌为肠道中最常见的一类细菌。依据它的致病性大致可分为:肠致病性大肠杆菌(Enter-opathogenic E.coli,EPEC),侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.eoli,EiEC)、产毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)及大肠埃希氏菌(E.coli)。

产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素的特性和作用机理

本文介绍产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热性肠毒素(ST)特性及作用机理的研究近况以及近年来新发现产ST样毒素的其它肠道菌,文中并介绍了检测ST的新方法。

产肠毒素性大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)提纯方法研究

本文运用硫酸铵沉淀、羟基磷灰右处理、酒精抽提、Sp-sephadex C-25阳离子交换凝胶柱及DEAE-Sephadex A-25阴离子交换凝胶柱交换洗脱以及高压液相色谱法进行产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热性肠毒素(ST)的纯化,从10000ml细菌培养液中获得纯化ST1.05mg。

产肠毒素大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)单克隆抗体研制及应用

本研究用小分子量大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)经戊二醛聚合成功地免疫了Balb/c小鼠,小鼠脾细胞与SP2/O小鼠骨髓瘤细胞融合,获得1株产生特异性ST单克隆抗体(STMcAb)的杂交瘤细胞株并用特的STMcAb建立了检测ETEc ST的竞争性ELISA。该方法检测ST的敏感性较乳鼠灌胃法(SMA)高30倍。用两种方法对330株腹泻监测点的大肠杆菌做平行试验,发现12个相同的菌株两种试验ST均阳性,其余菌株两种试验均阴性。

富马酸与肉桂醛联用调节产肠毒素型大肠杆菌诱导猪肠上皮细胞氧化应激的分子机制

本试验旨在研究富马酸(FA)与肉桂醛(CA)联用调节产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)K88诱导猪肠上皮细胞IPEC⁃J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC⁃J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC⁃J2细胞12和24 h,并用CCK⁃8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF⁃κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明:1)FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2)添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降(P<0.05),6、12和24 h时极显著下降(P<0.01)。3)添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)含量(P<0.01),极显著提高抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL⁃10)和转化生长因子-β(TGF⁃β)含量(P<0.01)。4)ETEC K88通过激活NF⁃κB信号通路诱导IPEC⁃J2细胞氧化损伤,添加FA和CA可上调Hsp70 mRNA相对表达量并抑制NF⁃κB信号通路缓解IPEC⁃J2细胞氧化应激。5)添加FA和CA可显著提高ETEC K88感染细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性(P<0.05),极显著降低丙二醛(MDA)含量(P<0.01)。综上所述,FA与CA联用可调节炎性细胞因子和氧化应激蛋白平衡并抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,其可能是通过上调Hsp70抑制NF⁃κB信号通路,增强IPEC⁃J2细胞的抗氧化和抗炎能力,从而缓解ETEC K88诱导的IPEC⁃J2细胞氧化应激。

原儿茶酸对肠毒素大肠杆菌K88诱导的猪小肠上皮细胞程序性坏死和Toll样受体4信号通路的影响

本试验旨在研究原儿茶酸(PCA)对肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的猪小肠上皮细胞(IPEC-1细胞)程序性坏死和Toll样受体4(TLR4)信号通路的影响。试验采用2×2因子设计,分为4个组:对照组、PCA组(40μmol/L PCA作用24 h)、ETEC K88组(50倍细胞数ETEC K88作用2 h)和PCA+ETEC K88(40μmol/L PCA作用24 h+50倍细胞数ETEC K88作用2 h)组,每组3个重复。结果显示:1)与对照组相比,ETEC K88组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组细胞活力显著升高(P<0.05),细胞上清液LDH活性显著降低(P<0.05)。2)与对照组相比,ETEC K88刺激导致细胞形态损伤,超微结构破坏,表现为细胞膜破裂,细胞核皱缩,染色质外溢,线粒体出现肿胀并且空泡化;ETEC K88组细胞坏死率显著升高(P<0.05)。与ETEC K88组相比,添加PCA能够保护细胞形态,PCA+ETEC K88组细胞坏死率显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,ETEC K88组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TLR4、脂多糖结合蛋白(LBP)、髓样分化蛋白2(MD2)、白细胞介素受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和髓样分化因子88(MyD 88)的mRNA相对表达显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组TNF-α、TLR4、LBP、MD2、IRAK1、TRAF6和MyD88的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。4)与对照组相比,ETEC K88组肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、Fas相关死亡结构域(FADD)、混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)、高迁移率蛋白1(HMGB1)、动力相关蛋白1(Drp1)和磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组TNFR1、FADD、HMGB1、Drp1和PGAM5的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。由此可见,PCA可能通过抑制细胞程序性坏死和TLR4信号通路的激活,缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞的炎症反应和损伤。

大肠杆菌耐热性肠毒素STI三重串联突变体与黏附素K99融合基因的表达研究

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种导致仔畜和婴儿腹泻的主要病原之一,它的毒力因子主要有两类:黏附素(CFAs)和耐热性肠毒素(ST)或不耐热性肠毒素(LT)。通过PCR技术及双酶切连接技术,成功构建了含有3个STI突变体和1个黏附素K99基因的重组表达质粒pE3S(S)LK和pE3S(G)LK。重组菌株BL21(DE3)(pE3S(S)LK)和BL21(DE3)(pE3S(G)LK)的表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹分析,表明以上两种重组菌株均能高效表达3STI(S)-K99和3STI(G)-K99融合蛋白,且融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。其次,利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性,结果均为阴性(G/C值≤0.083),这表明该菌株已无STI生物学毒性。这些为研发预防大肠杆菌性腹泻的新型高效多价基因工程疫苗提供了基本素材和理论指导。

大肠杆菌耐热性肠毒素STⅠ的分子生物学

大肠杆菌耐热性肠毒素(heat-stable toxin,ST)是分子结构与作用机理均不同于霍乱肠毒素或大肠杆菌LT的另一类引起腹泻的毒素当作用于肠粘膜上皮细胞时,ST不进入胞浆内,属于膜表面或膜内作用毒素。