大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。

热不稳定大肠杆菌肠毒素B亚单位免疫调节功能的实验研究

目的 :探讨大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LTB)的免疫调节功能及其可能的机制。方法 :用SephacrylS 10 0凝胶柱层析纯化LTB蛋白。选用BALB/c小鼠 ,以鸡溶菌酶 (HEL)为抗原 ,经鼻黏膜单独免疫 ,或以不同剂量的LTB为佐剂与HEL共免疫。用ELISA法检测血清和肠分泌液中HEL特异性抗体的水平。用3 H TdR掺入法 ,体外测定LTB蛋白对刀豆蛋白A(ConA)及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应的影响。结果 :HEL单独免疫组血清中仅有弱的抗HELIgG ,未检测到抗HELIgA ,且其肠分泌液中亦未见HEL特异性IgA抗体。但加用LTB佐剂的 3个组 ,其血清中抗HELIgG、IgA的水平及肠分泌液中抗HELIgA的水平均显著高于HEL单独免疫组 (P <0 .0 0 1)。体外实验显示 ,LTB可明显抑制ConA及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应。结论 :我们制备的LTB蛋白对免疫系统具有双向的调节功能 ,既可作为有效的黏膜佐剂 ,辅佐外来抗原刺激机体产生黏膜免疫应答 ,又具免疫抑制效应 ,有效地抑制淋巴细胞活化。LTB免疫调节功能的发挥 。

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分泌表达与性质鉴定

目的 较高效率分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位并鉴定其性质。方法 将编码成熟大肠杆菌不耐热肠毒素 (LTB)的基因引入pET2 2b(+)并转化E .coliBL2 1(DE3) ;重组工程菌在改良M9 CAA培养基内进行表达 ;对分泌表达的LTB进行纯化后进行神经节苷脂 (GM1)结合活性、免疫原性与黏膜免疫佐剂活性的鉴定。结果 LTB既能分泌表达至胞周质又能以包含体形式表达 ,两者都与pelB信号肽准确分离。纯化出的LTB具有正常的GM1结合活性、免疫原性及黏膜免疫佐剂活性。结论 pET2 2b(+)质粒的pelB信号肽可使LTB以较高效率分泌表达。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的纯化及生物学活性鉴定

目的 纯化rLTB并对其生物学功能进行初步研究。方法 重组基因工程菌发酵后 ,以包涵体形式表达的rLTB经过洗涤、变性溶解后 ,分别采用QSepharoseTM HighPerformance阴离子交换层析和PhenylFF(highsub)疏水层析对其进行纯化并透析复性 ,然后采用SDS PAGE和HPLC检测纯度 ,并选用ELISA、动物实验和Western blotting实验对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 得到纯度达 97 85 %的rLTB ,复性的rLTB经检测具有良好的生物学活性。结论 得到纯度较高、生物学活性较好的rLTB 。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素融合基因的构建及表达

为了构建含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与产气荚膜梭菌β1、β2毒素融合基因的表达菌株,试验将亚克隆LTB基因融合到β2-β1毒素基因的上游,构建了pET30a-LTB-β2-β1原核表达载体,经IPTG诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE检测和Western-blot分析。结果表明:重组菌株可以表达LTB-β2-β1融合蛋白,且该融合蛋白可以被相应的抗体识别。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的 研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因工程菌的发酵工艺。方法 先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件 ,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件 ,并进一步对发酵工艺进行改良优化。结果 经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合 ,优化后工程菌菌体产量平均可达 40 5g/L ,目的蛋白的表达率平均为 3 0 6%。结论 建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b-LTB表达载体、转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS-PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合表达载体的构建及应用

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的融合表达载体。方法 PCR扩增LTB基因 ,并在其 3′端去掉终止密码子 ,引入编码TAPI接头 ,通过EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位点重组于PinpointXa Ⅰ载体上 ,将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合 ,转化E .coliJM10 9,SDS PAGE及Westernblotting分析其表达。结果 成功构建了LTB融合表达质粒 ,并获得了幽门螺杆菌尿素酶B亚单位与之融合表达。结论 LTB融合表达载体的成功构建为研究分子内佐剂疫苗奠定了实验基础。

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的 获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位 (HspA)的融合蛋白。方法 PCR扩增ltB和hspA基因 ,依次构建至表达载体pIM 1,转化大肠杆菌 ,SDS PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1 ELISA和D(+) 半乳糖亲和层析方法检测重组LTB HspA融合蛋白LTB组分与GM1 神经节苷脂结合活性。结果 重组LTB HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的 2 5 %。免疫印迹检测结果证实为重组LTB HspA融合蛋白。GM1ELISA和D(+) 半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB HspA融合蛋白具有与GM1 神经节苷脂结合的活性。结论 LTB HspA融合蛋白的表达研究 。

大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价

构建了霍乱毒素B亚单位CTB和大肠杆菌热稳定肠毒素ST的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二者的不同是,前者为单拷贝ST,后者为双拷贝ST。在大肠杆菌DH5α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌中的分泌表达

以大肠杆菌和乳酸菌穿梭表达型载体pMG36e为基本模型,采用重叠延伸PCR方法拼接相关调控元件构建一种乳酸杆菌组成型分泌表达载体;将编码LTB蛋白的eltb基因片段插入干酪乳杆菌分泌型表达载体中,构建重组质粒pMG36e-UP/L-LTB,电转化于干酪乳杆菌393中,筛选获得重组干酪乳杆菌,应用western blot方法鉴定LTB表达情况。Western-blot分析显示,约有12 KDa的目的蛋白以分泌形式表达,可被LTB阳性血清识别。表明LTB蛋白在重组干酪乳杆菌获得了表达,并且具有免疫反应活性和佐剂活性,为以LTB为分子佐剂研制乳酸菌黏膜疫苗奠定基础。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在鸭体内的吸收代谢及组织分布

研究重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(rLTB)在鸭体内的吸收代谢及组织分布,为rLTB的临床应用安全性提供依据。试验鸭分别肌注1,50,100 mg/kg rLTB后,以神经节苷脂GM1酶联免疫吸附法(GM1-ELISA)测定注射后不同时间点鸭血清中的rLTB含量;连续3次肌注rLTB后,观察临床症状和剖检病理变化,并采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑制备组织切片,HE染色观察组织病理学变化,免疫酶组织化学染色观察rLTB在各脏器内的分布及含量变化。结果表明:鸭血清中的rLTB含量变化及维持时间与rLTB注射剂量呈正相关。1 mg/kg注射组2 h达到峰值,维持至6 h开始下降,24 h后基本检测不到;50,100 mg/kg注射组分别于2 h和1 h达到峰值,并均维持至12 h才开始下降,48 h后基本检测不到。HE染色切片显示50 mg/kg注射组肝细胞轻度浊肿变性,肺脏轻微炎症;100mg/kg注射组肝细胞浊肿变性明显、肺脏重度炎症、脑组织出现局灶性坏死。免疫组化染色结果显示,在被检脏器中均检出rLTB,以大脑含量最高,脾脏和肝脏次之,心脏和肺脏检出量低。rLTB大剂量肌肉注射可引起鸭一定的组织学病变,对鸭的安全使用剂量应不超过50 mg/kg。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。

产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位可有效诱导和增强对肠道病毒71型的黏膜免疫应答

目的研究产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的免疫原性。评价肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1联合LTB的鼻腔免疫效果。方法构建重组质粒pET32a-LTB,表达的6×His-LTB融合蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化后免疫新西兰大白兔制备抗血清,ELISA检测抗血清效价。用纯化的EV71 VP1、LTB联合EV71 VP1、生理盐水分别经鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集血清、肺和小肠黏膜冲洗液,采用间接ELISA检测IgG和分泌性IgA(sIgA)。结果已成功构建重组质粒pET32a-LTB。表达的6×His-LTB融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,免疫兔所制备的抗血清效价为1∶125 000。EV71 VP1联合LTB组的小鼠特异性IgG和sIgA水平较EV71 VP1单独免疫组和对照组有明显增高。结论在E.coli BL21(DE3)中成功表达了6×His-LTB融合蛋白,纯化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐剂活性。通过滴鼻免疫,LTB可有效增强特异性血清抗体反应,诱导黏膜免疫应答。

大肠杆菌热稳定肠毒素表位与霍乱毒素B亚单位的重组与表达

霍乱毒素B亚单位(CTB)是半抗原的良好载体,选择CTB基因的翻译调控元件,实现了串联重复的突变型大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)表位与CTB的重组,在大肠杆菌中高效分泌表达,经过亲和层析获得了高纯度的重组蛋白,ELISA表明重组蛋白仍保留与神经节苷脂GM1的结合能力和CTB的免疫原性。

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB、STⅠ肠毒素基因融合表达产物的免疫应答

合成O型口蹄疫病毒VP1蛋白中与细胞免疫（21～40表位肽）及体液免疫（141～160表位肽）相关的基因序列2020VP1，运用基因工程技术构建了含有肠毒素大肠杆菌LTB、STⅠ基因及双拷贝2020VP1的融合表达载体r2020-B-2020-STⅠ，转化宿主菌BL21（DE3）RIL后的表达产物经SDS—PAGE分析，结果显示重组融合蛋白的分子量约为45kDa，表达量较高。ELISA实验结果显示，融合蛋白能与霍乱毒素（cholera toxin）CTB抗体特异结合。动物实验表明，融合蛋白能够诱发兔体产生较强的FMDV中和抗体，免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应，说明融合蛋白能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应；同时，融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击，免疫兔体能够产生STⅠ中和抗体，且融合蛋白不具STⅠ毒性，证明融合蛋白具有良好的LTB、STⅠ免疫原性。实验结果表明，此融合蛋白具有开发成为口蹄疫及肠毒素腹泻联合疫苗的应用价值。

大肠杆菌O_(157):H_7 Stx2毒素B亚单位基因的克隆、序列分析及表达载体的构建

目的 克隆出血性大肠杆菌O157:H7的Stx2毒素B亚单位基因 ,进行序列分析并构建表达载体。方法 利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157:H7染色体基因组中扩增出Stx2毒素B亚单位基因 ,并连接至质粒载体上 ,进行序列测定和分析 ,亚克隆构建表达载体 ,经SDS PAGE电泳分析目的蛋白表达量。结果 所克隆的基因序列与Genbank上基因序列高度同源 ,所表达目的蛋白约占宿主菌蛋白的 2 0 %。