大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 ( CD)基因 ,构建真核表达载体 ,本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础。方法 根据 Gen Bank数据库提供的 CD基因核苷酸序列 ,设计并合成一对引物 ,采用 PCR方法 ,从大肠杆菌基因组 DNA中扩增出 CD基因 ,并与 pc DNA3.1定向连接 ,构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体 pc DNA3.1- CD,并用限制性内切酶、PCR和 DNA测序进行鉴定。结果 克隆了大肠杆菌 CD基因 ,并构建了真核表达载体 ,经限制性内切酶酶切、PCR扩增和 DNA测序证实了其正确性。结论 pc DNA 3.1- CD真核表达载体构建成功。

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。

大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达

将大肠杆菌K12菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add)克隆到载体pET-28a中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测和酶活性的测定发现,重组菌表达产生大量腺苷脱氨酶,活性达到51.07U/mg蛋白。通过酶性质的研究,腺苷脱氨酶对腺苷最适pH和温度分别为7.5和40℃,且在40℃下维持稳定。

婴儿双歧杆菌/胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统的构建

目的 构建婴儿双歧杆菌 /胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统。方法 PCR扩增胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因 ,TSS法在大肠杆菌JM 10 9中扩增 pGEX 1LambdaT质粒 ,EcoRⅠ和BamHⅠ对CD基因和pGEX 1LambdaT质粒分别进行双酶酶切。琼脂糖电泳凝胶分离并切取其中 4.9kb和 1.3kb两个片段长度的凝胶。凝胶DNA提取试剂盒提取其中所含的DNA片段 ,T4DNA连接酶连接这两个片段 ,最后用电穿孔法将重组片段转染婴儿双歧杆菌 ,并挑选阳性菌落 ,提取质粒双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果 应用电穿孔法转染婴儿双歧杆菌 ,获得含 6.2kbp重组质粒的阳性转染婴儿双歧杆菌。 结论 成功构建婴儿双歧杆菌 /胞嘧啶脱氨酶肿瘤靶向性基因治疗系统。

大肠杆菌CD自杀基因转染诱导肿细胞凋亡及旁观者效应的研究

以重组腺病毒AdCD为载体将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因体外传染小鼠红白血病细胞FBL3,结果显示,转染了CD基因的FBL3细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性显著提高,进一步研究发现,AdCD/5-FC系统可以诱导肿瘤细胞发生凋亡;将经AdCD/5-FC处理过的FBL3细胞上清倍比稀释后,加入到野生型FBL3细胞中,发现当上清仅占6.25％时,即对野生型FBL3细胞发挥明显的杀伤作用,提示旁观者效应在AdCD介导的细胞毒作用中起着重要的作用。本实验还观察了CD基因体内转染后的杀伤效果,荷瘤小鼠局部注射AdCD并连续10天给予5-FC(300mg/kg)治疗后,小鼠皮下肿瘤结节的生长受到明显抑制。

胞嘧啶脱氨酶基因联合干扰素-酌基因治疗大肠癌的实验研究

目的:研究胞嘧啶脱氨酶基因(EC鄄CD)联合干扰素-酌(INF鄄酌)基因对大肠癌的治疗作用。方法:以重组腺病毒载体AdCMVCD转导EC鄄CD基因;AdCMVINF鄄γ转导鼠INF鄄γ基因。采用体外培养和小鼠移植瘤实验,研究EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因对CT26大肠癌细胞的杀伤作用。结果:AdCMVIFN鄄γ感染对CT26细胞生长有明显的抑制作用。AdCMVCD/5鄄FC联合AdCMVINF鄄γ可以增强对CT26细胞的杀伤作用,IC50明显变小(P<0.01),肿瘤生长明显抑制(P<0.01)。组织学检查显示,EC鄄CD基因与INF鄄γ基因联合治疗后肿瘤内有大量淋巴细胞浸润。结论:EC鄄CD基因联合INF鄄γ基因可以明显增强抗肿瘤效应,局部淋巴细胞浸润增加可能起到一定作用。

Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

目的探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果。方法利用Survivin启动子替换p EGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体p Sur P-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在p Sur P-EGFP中,构建成重组载体p Sur P-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡。结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果。结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果。

携带重组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤效应研究

目的 将携带胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因的重组婴儿双歧杆菌应用于肿瘤的基因导向酶前药物疗法 ,利用厌氧菌趋低氧代谢的特性构建一种全新的肿瘤靶向基因治疗系统。方法 PCR扩增CD目的基因、酶切后连接目的基因与质粒片段 ,电穿孔法将重组体转染婴儿双歧杆菌 ,筛选阳性克隆抽提质粒 ,酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,并体外检测CD基因的表达。结果 携带自杀基因CD的重组载体成功地被转染进婴儿双歧杆菌 ,并能表达CD酶活性 ,当加入CD酶底物 5 -FC后 ,显示出对小鼠黑色素瘤B16 -F10细胞明显的杀伤效应。结论 成功构建了携带自杀基因CD的重组婴儿双歧杆菌 ,重组菌在体外显示出对B16

人生长抑素受体-2和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达细胞系的建立及其对5-氟胞嘧啶杀伤的敏感性

目的建立共表达人生长抑素受体2(SSTR2)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)的细胞系,为“自杀基因”/前体药物系统联合SSTR2介导的放射性免疫杀伤和显像治疗肿瘤提供细胞模型。方法应用反转录PCR方法从人胚肾293细胞中克隆人sstr2基因,通过基因重叠延伸拼接(SOE)结合PCR方法将CD、内部核糖体进入位点(IRES2)和sstr2连接,并构建表达载体。体外转染人乳腺癌SKBr3细胞并筛选,通过间接免疫荧光检测SSTR2的表达,并研究前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)对上述细胞的杀伤作用。结果成功克隆了人sstr2基因,并构建了CD和sstr2基因的双顺反子表达载体,进一步建立了稳定转染上述表达载体的SKBr3细胞系,间接免疫荧光证实了SSTR2的表达,同时建系细胞能够被前体药物5-FC高效杀伤。结论本研究建立的人乳腺癌细胞系可以共表达sstr2和CD基因,为在体内研究放射性核素标记的SSTR2配体显像和免疫杀伤,并协同CD/5-FC治疗肿瘤奠定基础。

抗人大肠癌单链抗体—胞嘧啶脱氨酶融合基因的构建及表达

目的:构建抗人大肠癌重组单链抗体ND-1scFv与酵母胞嘧啶脱氨酶CD的融合基因,并在大肠杆菌中表达.方法:采用基因重组技术借助GSGGSGLinker序列将酵母胞嘧啶脱氨酶基因融合于ND-1scFv基因的3'端,构建pET-28a(+)ND-1scFv-CD载体,转化E.coliBL21,经IPTG诱导,表达二者的融合蛋白.表达产物用Ni-NTAresin亲和层析方法纯化,并采用ELISA检测其免疫活性,MTT法测定由ND-1scFv-CD/5FC构成的ADEPT系统对大肠癌细胞的体外杀伤作用.结果:序列测定表明:ND-1scFv-CD基因全长1269bp,包含了732bp的scFv基因和477bp的CD基因.SDS-PAGE检测显示,融合蛋白相对分子质量47KDa,与预测值一致.光密度扫描结果表明,重组蛋白占菌体蛋白总量的27%,ELISA检测证实,ND-1scFv-CD保留了与ND-1scFv相近的免疫活性.MTT实验检测结果显示,由scFv-CD/5FC构成的ADEPT体系对大肠癌细胞具靶向杀伤作用.结论:成功地构建了抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv与酵母胞嘧啶脱氨酶CD的融合蛋白,并在大肠杆菌中高效表达.融合蛋白具有良好的免疫活性和一定的酶活性.

人CD7胞外区基因在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌中表达人白细胞分化抗原 CD7胞外区蛋白。方法采用 PCR技术调整 CD7基因的阅读框架 ,使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致 ,缺失了 CD7c DNA基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子 ,构建CD7胞外区 c DNA和生物素化蛋白基因融合的原核表达质粒 Pin Pointxa3- CD7。将重组质粒转入大肠杆菌 DH5 α表达 ,SDS-PAGE及 Western blotting鉴定结果。结果融合蛋白的分子量约为 30 0 0 0 u,Western blotting结果表明 :表达的蛋白质可被抗CD7的单克隆抗体识别。结论为研制抗

CD14基因在大白猪F18大肠杆菌病耐受型和敏感型个体间的差异表达分析

本研究旨在分析CD14基因在大白猪F18大肠杆菌耐受型和敏感型个体间的mRNA表达差异,以探讨CD14基因在断奶仔猪抗F18大肠杆菌中发挥的潜在作用。挑选大白猪耐受型和敏感型个体各4头,通过利用Real-time PCR方法比较分析CD14基因在个体各组织间的表达规律。结果表明:CD14基因在大白猪耐受型和敏感型个体各组织间的表达趋势有着高度的一致性,其中CD14基因在肝中呈现高水平表达,在肺、肾和淋巴结中呈现中度表达,而在其他组织中的表达水平都非常低,CD14基因在耐受型个体各组织间的表达水平几乎都高于敏感组,其中CD14基因表达量在空肠组织中差异达到极显著水平(P<0.01)。由此推测,CD14基因对E.coli F18抗性的调节可能不是通过直接作为F18大肠杆菌的受体来实现,而是通过参与并调节机体的免疫反应来实现的,并且CD14基因的上调可能与F18大肠杆菌的抗性存在一定的联系。

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶 (Cytimidinedeaminase ,CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD ,限制性内切酶消化鉴定后 ,采用Lipofectamine 2 0 0 0脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞 (Neuralstemcells ,NSCs) ,G418筛选阳性克隆 ,加入不同浓度的 5 氟胞嘧啶 ( 5 Flourocytosine ,5 FC) ,MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞 ,并将CD基因成功地转染了神经干细胞 ,G418阳性NSCs对低浓度 5 FC高度敏感。

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合黄连素对直肠癌细胞的杀伤作用

目的：探讨黄连素联合腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因（A＆CD）对直肠癌细胞的体外杀伤作用。方法：用重组腺病毒介导外源CD基因转染到人直肠癌细胞株HR-8348，检测病毒的转导效率和CD基因表达。用四甲基偶氮唑盐（MTT法）检测黄连素联合Ad-CD基因对HR-8348细胞存活率及体外旁观者效应的影响。结果：在250μg／ml5-氟胞嘧啶（5-FC）浓度下，0．1、0．3、3．0、30．0μmol／L浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞生长抑制率分别为27．70%、42．4％、52．3％、56．3％。3．0μmol／L浓度的黄连素可作为参考用药浓度。在转染和未转染CD基因的HR-8348混合体系中，黄连素联合CD／5-FC对直肠癌细胞具有更强的抑制作用。结论：黄连素可以增强自杀基因系统对直肠癌细胞的杀伤作用，可作为一种增效剂应用于直肠癌的治疗。

癌胚抗原启动子控制胞嘧啶脱氨酶基因体外对结肠癌细胞专一性杀伤

目的 :研究癌胚抗原 (CEA)启动子是否能控制大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (EC CD)基因在CEA阳性结肠癌细胞中专一性表达和杀伤结肠癌细胞。方法 :构建由CEA启动子驱动的含EC CD基因的重组腺病毒载体AdCEACD与由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的含EC CD基因的腺病毒载体AdCMVCD ,分别感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo细胞和CEA阴性的Hela细胞 ,用RT PCR法检测受染细胞中EC CD基因的表达 ,并用MTT法检测感染后细胞对 5 氟胞嘧啶 (5 FC)的敏感性。结果 :Lovo细胞在AdCMVCD及AdCEACD感染后均有EC CDmRNA表达 ,且对 5 FC的敏感性明显增强 ,Hela细胞在AdCMVCD感染后有EC CDmRNA表达 ,对 5 FC的敏感性增强 ,而在AdCEACD感染后则没有EC CDmRNA表达 ,5 FC对其亦无杀伤作用。结论 :CEA启动子能够控制EC CD基因专一性地在CEA阳性的结肠癌细胞中表达 ,从而实现EC

胞嘧啶脱氨酶基因旁观者效应与宿主免疫状态关系

目的 :研究胞嘧啶脱氨酶自杀基因 (E .Coli.cytosingedeaminasegene ,EC CD)旁观者效应与宿主免疫状态的关系。方法 :CT2 6细胞分别接种于Balb/c小鼠及Balb/cnu/nu裸鼠皮下 ,每只动物接种相互分离的两处 ,在其中一处瘤体内接种AdCMVCD ,腹腔给予氟胞嘧啶 (5 fluorocytosine ,5 FC) ,观察肿瘤体积的变化。并用FCM检测肿瘤浸润淋巴细胞CD3、CD4、CD8的表达情况。结果 :Balb/c小鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 95 2± 898 6 5mm3 ,其对侧为 2 5 74 8± 339 0 5mm3 ,均明显小于对照组 (P =0 0 0 9,P =0 0 12 )。Balb/cnu/nu裸鼠中 ,治疗组接种病毒侧瘤体积为 2 4 32 6± 36 8 5 3mm3 ,明显小于对照组(P =0 0 15 ) ,而其对侧为 396 0 9± 12 80 76mm3 ,明显大于治疗组接种侧 (P =0 0 4 9) ,但与对照组两侧间均无差异。FCM显示Balb/cnu/nu裸鼠体内肿瘤浸润淋巴细胞主要是CD3+、CD4 +的淋巴细胞 ,而Balb/c小鼠体内肿瘤主要是CD3+、CD8+的淋巴细胞。结论 :EC CD/ 5 FC系统的旁观者效应特别是远距离旁观者效应与宿主免疫状况有关 ,在免疫健全宿主中旁观者效应较强。

构建携带胞嘧啶脱氨酶基因骨髓间充质干细胞及其对胶质瘤细胞的体外抑制作用

背景:转染胞嘧啶脱氨酶基因的骨髓间充质干细胞能有效地将化疗前药5-氟尿嘧啶转化成具有细胞毒性的化疗药物5-氟尿嘧啶,并在体外对胶质瘤细胞有显著的生长抑制作用。目的:探讨以骨髓间充质干细胞为基因治疗载体表达外源基因胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤C6细胞增殖的影响。方法:分离、培养小鼠间充质干细胞,构建胞嘧啶脱氨酶基因与GFP联合的慢病毒载体,通过慢病毒包装法将胞嘧啶脱氨酶基因及GFP转染至小鼠骨髓间充质干细胞,获得稳定表达胞嘧啶脱氨酶基因及GFP的骨髓间充质干细胞,使其与胶质瘤C6细胞共培养,在培养液中加入5-氟胞嘧啶后应用流式细胞仪检测胞嘧啶脱氨酶基因对胶质瘤细胞的增殖影响。结果与结论:慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶基因及GFP基因成功转染小鼠骨髓间充质干细胞形成C57BL/6mMSC-codA/eGFP细胞,C57BL/6mMSC-codA/eGFP在5-氟胞嘧啶的作用下可引起胶质瘤C6细胞的明显凋亡,在5-氟胞嘧啶浓度为1×106μg/L条件下C6胶质瘤细胞凋亡率为60%(P<0.05)。提示,C57BL/6mMSC-codA/eGFP可将5-氟胞嘧啶转化成5-氟尿嘧啶并对C6胶质瘤细胞生长有显著的限制作用甚至是致死效应。

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV+5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。

mdrl启动子调控胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的抑制作用

目的：观察人多药耐药基因mdr1启动子调控的胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合自杀基因（CD：：upp）对紫杉醇耐药卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及对荷瘤裸鼠生存时间的影响。方法：建立卵巢癌耐药及非耐药细胞的裸鼠模型，将含mdr1-CD：：upp的重组腺病毒0．1ml（1×10^9pfu／ml）注入裸鼠皮下移植瘤体内，腹腔内注射5-氟胞嘧啶（5-FC），观察各组裸鼠肿瘤生长速度及存活时间。结果：实验组裸鼠移植瘤明显受到抑制，与对照组的差异有统计学意义（P〈0．05）。实验组荷瘤裸鼠的生存时间明显延长，对照组在69天内全部死亡，差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：mdr1启动子调控的CD：：upp基因能特异性地抑制卵巢癌裸鼠耐药移植瘤的生长并延长生存时间。

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合α-IFN治疗肾癌的实验观察

目的:探讨腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因联合α-IFN对肾癌的治疗作用.方法:含CD基因重组腺病毒感染人肾癌细胞株786-0,用噻唑蓝(MTT)方法观察加用5-氟胞嘧啶(5-Fc)或联用α-IFN后的杀伤效应.建立786-0裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射腺病毒,腹腔注射5-Fc(500mg/kg),联合应用α-IFN时行瘤内注射,观察肿瘤生长情况.结果:在对感染腺病毒的786-0细胞的体外杀伤实验中,CD+5-Fc组的细胞存活率为(67.40±1.27)%,α-IFN组的细胞存活率为(68.65±1.45)%,CD+5-Fc+α-IFN组细胞存活率为(34.67±2.38)%,(P=0.000),两者之间有协同效应.在786-0裸鼠移植瘤模型中,CD+5-Fc联合α-IFN能够显著抑制肿瘤的生长.结论:腺病毒为载体的自杀基因CD加前体药5-Fc联合α-IFN可以明显增强抗肾癌效果.