大肠杆菌非偏爱密码子的数量及位置对外源蛋白表达的影响

目的:研究大肠杆菌非偏爱密码子GGG在目的蛋白中的数量及位置对原核表达体系的影响。方法:以内皮抑素为研究对象,利用Overlapping-PCR定点突变内皮抑素中部密码子为GGG,构建到载体pET28a中,研究内皮抑素表达水平。结果:一个GGG密码子存在并不会降低或者阻止内皮抑素的表达,两个GGG存在并且距离很近时可显著降低内皮抑素的表达,当3个GGG串联存在时可阻止内皮抑素的表达。结论:GGG数量以及位置的不同可对外源目的蛋白的表达水平造成显著影响。

猪细小病毒主要非结构蛋白与结构蛋白的密码子偏爱性分析

通过分析猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)主要非结构蛋白(non-structural protein,NS1)及结构蛋白(VP1、VP2)的密码子偏爱性,为三种蛋白基因表达中宿主系统的选择提供参考。运用EMBOSS(The European Molecular Biology Open Software Suite)的CHIPS(Codon Heterozygosity in aProtein Coding Sequence)和CUSP(Create a codon usage table)程序对PPV的NS1、VP1和VP2蛋白基因进行分析,并将分析结果与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性进行比较。结果显示,PPV的NS1、VP1、VP2基因的Nc(Effective number of codons)值分别为39.696、36.638和36.482,表明三种蛋白存在较明显的密码子偏爱性,并且均偏爱选择第三位核苷酸为A的密码子。PPV三种蛋白与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性也有一定差异,其中与酵母的密码子偏爱性差异最小,其表达系统选择酵母较为合适。

WSSV-VP37小肽在大肠杆菌中的偏爱型表达

选用对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)囊膜蛋白VP37的功能区段,利用大肠杆菌密码子偏爱性,在氨基酸不变的情况下将VP37中的密码子通过人工合成改为大肠杆菌偏爱型密码子,并克隆至表达载体pBAD/gIIIA中,构成重组载体pBAD/gIIIA-VP37p′。将重组载体转化入大肠杆菌Top10中,在相同条件下用L-阿拉伯糖与未优化的重组菌株Top10-pBAD/gIIIA-VP37p一同诱导。结果显示,与野生型基因VP37p相比,经密码子优化的VP37p′基因表达目的蛋白量占总蛋白的40.5%,明显高于野生型6.5%的目的蛋白表达量。

透明颤菌血红蛋白基因的植物化改造合成及其在大肠杆菌中功能的鉴定

根据透明颤菌血红蛋白(VHb)的氨基酸序列,按照植物偏爱密码子,对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)进行优化改造,同时考虑到可实现分别克隆拼接的酶切位点,设计并合成了22条单链DNA短片段,通过拼接获得了全长450bp的透明颤菌血红蛋白基因vgbM,并将其克隆至pUC19上,获得重组质粒pGSVHB。利用设计的引物,通过PCR在vgbM基因的5′端引入NcoⅠ位点,将其克隆到原核生物高效表达载体pBV221上,获得质粒pBV221SVHB。转化E.coli.BL21并经热激诱导表达后,在培养物中检测到了约16kD的VHb蛋白。经CO差示光谱分析测定,该蛋白具有生物活性。为透明颤菌血红蛋白基因vgbM在植物基因工程研究中的应用奠定了基础。

抗真菌蛋白Rs-AFP_2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响,利用PCR重叠延伸法,对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变,构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明,PCR产物全长240bp,有一个阅读框,编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成。突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比,在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA),第5号氨基酸Gln相差一个碱基(CAG→CAA),第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA)。重新合成引物,将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b(+)分别重组到大肠杆菌BL21菌株。IPTG诱导后,二者均得到了表达。软件分析显示,突变前pETAFPo表达产物占全菌蛋白的3％,突变后pETAFPm的表达产物占全菌蛋白含量的8％;表达蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经超声波破碎后,蛋白质复性,抑菌结果表明,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比,已有效地提高表达量。