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一步法制备大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化 被引量:6
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作者 张迹 李智 +1 位作者 张宇 袁巧云 《江苏农业科学》 北大核心 2016年第12期529-532,共4页
大肠杆菌BL21(DE3)菌株是大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株,因此人们需要1种便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。一步法感受态细胞制备操作方便,只加1种试剂即可,更快捷稳定,转化也更方便,不需要热激。研究大肠杆菌感受态细胞一步法... 大肠杆菌BL21(DE3)菌株是大肠杆菌表达系统最常用的宿主菌株,因此人们需要1种便捷有效的感受态细胞制备和转化方法。一步法感受态细胞制备操作方便,只加1种试剂即可,更快捷稳定,转化也更方便,不需要热激。研究大肠杆菌感受态细胞一步法制备对BL21菌株的适用性,并对转化过程中的关键参数进行探索和优化。结果表明,该一步法制备的BL21菌株感受态细胞可获得106CFU/μg DNA转化效率,完全能够满足常规转化要求。转化过程中相关参数的最佳条件为冰水浴30 min,室温放置10 min,37℃、150 r/min振荡复苏40 min。 展开更多
关键词 感受态细胞制备 一步法 大肠杆菌bl21(de3)菌株 转化条件
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大肠杆菌BL21(DE3)lpxM突变株的构建 被引量:2
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作者 张君 方宏清 +2 位作者 谢达平 刘志敏 陈惠鹏 《生物技术通讯》 CAS 2006年第4期489-492,共4页
目的:lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株,并考察该突变株的生长状态和表达重组蛋白的能力。方法:构建同源臂长500bp左右的打靶载体,借助Red同源重组系统,使E.coliBL21(DE3)的lpxM基因发... 目的:lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株,并考察该突变株的生长状态和表达重组蛋白的能力。方法:构建同源臂长500bp左右的打靶载体,借助Red同源重组系统,使E.coliBL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活,再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20去除抗性基因。PCR鉴定发生插入突变的菌株,应用SDS-PAGE分析突变前后的脂多糖,考查对重组蛋白表达的影响。结果:PCR鉴定结果说明lpxM基因发生了插入突变。与出发株比较,突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化,但其生长状态与表达重组蛋白的能力与出发株基本一致。结论:大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株可以用于重组蛋白的表达。 展开更多
关键词 大肠杆菌bl21(de3) lpxM基因 Red同源重组系统
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基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建 被引量:2
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作者 张飞飞 石牡丹 尚广东 《安徽农业科学》 CAS 2015年第20期29-31,72,共4页
[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率。[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能。[结果]敲除了编码降解外源DNA的I型限制性内切酶的hsdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BL21(DE3)仍保持... [目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率。[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能。[结果]敲除了编码降解外源DNA的I型限制性内切酶的hsdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BL21(DE3)仍保持一致的LS1928菌株。[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料,进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用。 展开更多
关键词 重组工程 基因敲除 双链断裂修复 大肠杆菌bl21(de3)
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rimJ基因缺失不影响大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性
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作者 颛孙丹丹 方宏清 +3 位作者 戴红梅 李树龙 谢迟 陈惠鹏 《生物技术通讯》 CAS 2010年第4期505-508,共4页
目的:研究rimJ基因对大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性的影响。方法:利用SceⅠ-Red同源重组技术将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的rimJ基因缺失,得到rimJ缺失突变菌;比较缺失突变株和原始菌株在不同温度(25℃、37℃、42℃)下的最大... 目的:研究rimJ基因对大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性的影响。方法:利用SceⅠ-Red同源重组技术将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的rimJ基因缺失,得到rimJ缺失突变菌;比较缺失突变株和原始菌株在不同温度(25℃、37℃、42℃)下的最大比生长速率,利用统计学方法分析rimJ基因的缺失对BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性是否有影响。结果:rimJ基因被成功敲除;统计分析结果表明缺失突变株和原始菌株的最大比生长速率没有明显区别。结论:rimJ基因缺失对大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性无影响。 展开更多
关键词 rimJ基因 大肠杆菌bl21(de3) 比生长速率 SceⅠ-Red同源重组 温度敏感性
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枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆及其在E.coliBL21(DE3)plysS中的表达 被引量:3
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作者 张立全 刘慧 +6 位作者 苏慧敏 扈廷茂 侯鑫 扈会平 邢万金 常福厚 王永胜 《内蒙古大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期284-287,共4页
用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因.利用基因重组技... 用CTAB法从枯草杆菌(纳豆株)中提取基因组DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得837bp的DNA片段,将该基因片断克隆到pMD18-T载体上,筛选重组子,通过限制性内切酶、PCR技术和测序分析确定该重组子所含插入片断为纳豆激酶基因.利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的融合表达载体,转化E.coliBL21(DE3)plysS后经IPTG诱导在大肠杆菌中高效表达,经SDS-PAGE电泳及bandscan软件分析融合蛋白分子量约为33.4kD,约占菌体总蛋白29.4%. 展开更多
关键词 枯草杆菌 纳豆激酶 克隆表达 bl21(de3)plyss
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重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 被引量:12
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作者 敬科举 徐志南 +1 位作者 林建平 岑沛霖 《催化学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第11期993-998,共6页
从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有... 从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用. 展开更多
关键词 重组细胞 大肠杆菌 E.COLI bl21(pET28-ALR0105)菌株 醛基还原酶 生物催化 4-氯乙酰乙酸乙酯 不对称还原 (R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
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Expression of Duck Interferon Alpha in BL21(DE3)plysS
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作者 RENGui-ping QUJuan-juan +4 位作者 PEIFu-cheng LIJing-peng LIUXiang-yu LILu WANGJun-wei 《Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)》 CAS 2005年第1期11-13,共3页
To obtain the protein of duck interferon alpha and study its biological activities, the prokaryotic expression vector of DuIFN-αwas constructed and expressed in BL21 (DE3) plysS. Using PCR technique, the protein gene... To obtain the protein of duck interferon alpha and study its biological activities, the prokaryotic expression vector of DuIFN-αwas constructed and expressed in BL21 (DE3) plysS. Using PCR technique, the protein gene of DuIFN-αwas cloned from pMD-18-duIFN-αrecombinant. The gene was then inserted to pGEM-T vector and identified by restriction endonuclease analysis and sequencing. DuIFN-αwas ligated with the prokaryotic expression vector of pET30 a, then transformed into BL21 (DE3) plysS. The best inducing time and IPTG concentration for the expression of this recombinant protein was tested through the expression of the positive recombinant with different time span and different IPTG concentration. Lots of the protein of DuIFN-αwere expressed in BL21(DE3)plysS with 1 mmol·L-1 IPTG for 4 hours and its molecular weight for 34 000. 展开更多
关键词 DUCK Α-INTERFERON clonging EXPRESSION bl21(de3)plyss
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重组大肠杆菌高效表达hbFGF的培养条件 被引量:1
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作者 廖美德 谢秋玲 +3 位作者 林剑 洪岸 孙奋勇 梁世中 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2002年第6期73-75,80,共4页
对工程菌hbFGF/BL2 1(DE3) pLysS高效表达hbFGF的培养条件的研究结果表明 ,接种量 (φ)为 5 % ,当培养液菌体浓度为 0 .8OD6 0 0 时 ,添加 0 .5mmol/L诱导剂IPTG可以获得较高的hbFGF表达量 ,30 %的溶解氧和较低的醋酸浓度有利于hbFGF的... 对工程菌hbFGF/BL2 1(DE3) pLysS高效表达hbFGF的培养条件的研究结果表明 ,接种量 (φ)为 5 % ,当培养液菌体浓度为 0 .8OD6 0 0 时 ,添加 0 .5mmol/L诱导剂IPTG可以获得较高的hbFGF表达量 ,30 %的溶解氧和较低的醋酸浓度有利于hbFGF的表达 . 展开更多
关键词 人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF) hbFGF/bl21(de3)plyss 培养条件
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基因工程大肠杆菌合成γ-聚谷氨酸 被引量:5
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作者 马婕 王丹 +2 位作者 李强 邢建民 刘会洲 《过程工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期791-795,共5页
利用PCR方法,从自身不合成γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的Bacillussubtilis168菌的基因组DNA中扩增出γ-PGA合成基因ywsC,ywtA和ywtB,测序并对该基因编码区进行序列分析,比对结果表明,扩增的ywsC,ywtA和ywtB与文献报道的相似度为100%.将3个基因... 利用PCR方法,从自身不合成γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的Bacillussubtilis168菌的基因组DNA中扩增出γ-PGA合成基因ywsC,ywtA和ywtB,测序并对该基因编码区进行序列分析,比对结果表明,扩增的ywsC,ywtA和ywtB与文献报道的相似度为100%.将3个基因连接到pTrcHisA载体后转化至E.coliTOP10及E.coliBL21(DE3)宿主菌表达,结果宿主菌细胞均具备了γ-PGA生物合成能力,产量最高达到0.134g/L. 展开更多
关键词 Γ-聚谷氨酸 枯草芽孢杆菌B.subtilis168 大肠杆菌TOP10 大肠杆菌bl21(de3)
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高密度培养大肠杆菌表达人角质细胞生长因子 被引量:3
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作者 卓山龄 孙金鹏 +3 位作者 陈溥 傅成龙 凌雪萍 卢英华 《厦门大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期82-87,共6页
角质细胞生长因子(KGF)是成纤维生长因子家族(FGF)成员,与上皮细胞增殖、组织胚胎发育、创伤修复等过程密切相关.在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆KGF基因,并进行诱导表达条件的优化.使用合成培养基,应用底物反馈流加策略将糖浓度控制在较低水... 角质细胞生长因子(KGF)是成纤维生长因子家族(FGF)成员,与上皮细胞增殖、组织胚胎发育、创伤修复等过程密切相关.在大肠杆菌BL21(DE3)中克隆KGF基因,并进行诱导表达条件的优化.使用合成培养基,应用底物反馈流加策略将糖浓度控制在较低水平,在发酵罐中高密度培养,细胞干质量浓度可以达到46 g/L.发酵罐培养的大肠杆菌在对数生长期经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在可溶性和不溶性产物中都得到了具有免疫学活性的GST-KGF融合蛋白,经过ELISA检测,发酵液中可溶性表达的KGF产率达到108μg/L.该研究为利用原核表达系统生产活性KGF建立了优化工艺,有利于将大规模生产用于创伤修复的KGF. 展开更多
关键词 角质细胞生长因子 大肠杆菌bl21(de3) 表达 高密度培养
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牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测 被引量:3
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作者 张俊瑞 马夏吟 +1 位作者 张红星 郝彦玲 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2012年第3期4-6,共3页
以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/... 以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。 展开更多
关键词 牛凝乳酶原 高效表达 大肠杆菌bl21(de3) 凝乳活性
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常见电子介体对大肠杆菌微生物燃料电池产电性能的影响 被引量:1
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作者 刘海霞 李雪明 +1 位作者 宋天顺 谢婧婧 《生物加工过程》 CAS 2019年第5期474-480,共7页
采用平板涂布研究电子介体中性红、亚甲基蓝和甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)细胞生长的抑制情况。通过微生物燃料电池技术(MFC)研究同一浓度下上述电子介体对大肠杆菌BL21(DE3)产电性能的影响。结果表明:甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)的... 采用平板涂布研究电子介体中性红、亚甲基蓝和甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)细胞生长的抑制情况。通过微生物燃料电池技术(MFC)研究同一浓度下上述电子介体对大肠杆菌BL21(DE3)产电性能的影响。结果表明:甲基紫精对大肠杆菌BL21(DE3)的生长抑制最强,中性红对大肠杆菌BL21(DE3)的生长抑制作用较弱;添加亚甲基蓝对于大肠杆菌BL21(DE3)MFC产电性能的提高显著;添加0.06g/L亚甲基蓝对大肠杆菌BL21(DE3)MFC产电性能的加强效果最好。 展开更多
关键词 微生物燃料电池 大肠杆菌bl21(de3) 电子介体 中性红 亚甲基蓝 甲基紫精 产电性能
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梅花鹿鹿茸S100A4融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化
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作者 刘东 邢秀梅 +4 位作者 赵海平 褚文辉 鲁晓萍 王大涛 李春义 《特产研究》 2011年第2期7-10,共4页
我们的前期研究表明,鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸骨膜。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制... 我们的前期研究表明,鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸骨膜。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制需要高质量S100A4的纯品。为了解决这一问题,我们针对已从梅花鹿AP细胞反转录出的S100A4基因序列,设计了含有EcoR I和BamH I酶切位点的上下游引物,并扩增出了目的片段。其后将S100A4基因片段和PGEX-6P-1载体酶切并进行了连接,转入Top10F’感受态细胞中,涂板筛选出了阳性克隆,进行了菌液PCR及双酶切鉴定,再将重组质粒转入了BL21(DE3)pLys S表达菌株进行了IPTG诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot鉴定表明融合蛋白成功表达,随后对融合蛋白进行了纯化。本研究成功地实现了鹿本身特有的S100A4基因的体外表达。 展开更多
关键词 S100A4 PGEX-6P-1 bl21(de3)plyss 蛋白表达
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大肠杆菌BL21(DE3)膜组分相关基因的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响
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作者 朱芸 周有治 +1 位作者 储建林 何冰芳 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1551-1559,共9页
【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waa F或msb B的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21(DE3)染色体上的基因waa F或msb B敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(Δwaa F)、E... 【目的】探究Escherichia coli BL21(DE3)中膜组分相关的脂多糖合成基因waa F或msb B的敲除对重组蛋白胞外分泌的影响。【方法】运用Red重组技术将E.coli BL21(DE3)染色体上的基因waa F或msb B敲除,构建敲除菌株E.coli BL21(Δwaa F)、E.coli BL21(Δmsb B)。将本实验室保存的带有β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)、青霉素G酰化酶(penicillin G acylase,PGA)基因的重组质粒p ET-ffase、p ET-pga分别转入敲除菌株及出发菌株中,构建工程菌株E.coli BL21(Δmsb B)/p ET-ffase、E.coli BL21(Δwaa F)/p ET-ffase、E.coli BL21(DE3)/p ET-ffase、E.coli BL21(Δmsb B)/p ET-pga、E.coli BL21(Δwaa F)/p ET-pga、E.coli BL21(DE3)/p ET-pga。最后通过摇瓶发酵研究敲除菌株对β-FFase、PGA胞外分泌的影响。【结果】当诱导表达4 h,以出发菌株E.coli BL21(DE3)为宿主时,β-呋喃果糖苷酶β-FFase的胞外分泌量占总表达量的2.6%,以敲除菌株Δmsb B为宿主时,胞外分泌量达到19.7%,而以敲除菌株Δwaa F为宿主时,胞外分泌量达到50.9%。另外,当诱导表达24 h,以敲除菌株Δwaa F为宿主时,青霉素G酰化酶PGA的胞外酶活是出发菌株中的4.1倍,达到1708 U/L。【结论】本研究成功构建了敲除菌株Δmsb B和Δwaa F,Δmsb B能明显增强β-FFase的胞外分泌,而Δwaa F对β-FFase和PGA的胞外分泌均有显著的强化作用。 展开更多
关键词 大肠杆菌bl21(de3) 膜脂 基因敲除
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大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究 被引量:3
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作者 涂宇鹏 何京桦 +1 位作者 乐科易 严维耀 《复旦学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期796-802,共7页
氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖—磷酸转移酶系统操纵子(m... 氨基葡萄糖(Glucosamine,GlcN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖—磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GlcN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GlcN的初步特性. 展开更多
关键词 大肠杆菌bl21(de3) 氨基葡萄糖 λRed同源重组 氨基葡萄糖合成酶 代谢工程
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枯草芽孢杆菌bioI基因的克隆和高效表达及BioI蛋白的纯化
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作者 龚月生 王晶 +4 位作者 刘锦妮 袁新宇 姬生跃 王俊 杨明明 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2008年第12期35-40,共6页
【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bio... 【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 bioI基因 大肠杆菌bl21(de3) 高效表达
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7紧密黏附素免疫保护性片段的基因克隆与表达 被引量:9
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作者 易勇 邹全明 +4 位作者 程建平 毛旭虎 曾明 朱永红 童文德 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期142-145,共4页
目的 克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法 设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原... 目的 克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法 设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测。结果 PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增出了约 2 80 0bp和 90 0bp的目的片段 ;原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5 %和 30 %;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 96× 1 0 3和 35× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达。结论 EHECO1 5 7∶H7紧密黏附素免疫保护性片段经基因克隆后获得了较高的表达量 ,为进一步的生物学性质及免疫学特性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌O157:H7 免疫保护性 基因克隆 黏附素 片段 bl21(de3) 原核表达质粒 E.coli 基因组扩增 EHEC 相对分子质量 PCR法 PAGE T-A克隆 蛋白表达率 生物学性质 克隆表达 设计引物 编码基因 诱导表达 特性研究
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重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究 被引量:2
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作者 吴超 冯强 +3 位作者 曾韦锟 郭桐生 高志刚 邹全明 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期307-311,共5页
目的 对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法 应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达... 目的 对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法 应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果 PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论 所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 黏膜佐剂 活性研究 bl21(de3) 产肠毒素大肠杆菌 BALB/c小鼠 神经节苷脂GM1 肠毒素B基因 原核表达载体 重组蛋白 PCR技术 亲和层析柱 亚单位蛋白 幽门螺杆菌 LTB基因 核苷酸序列 免疫反应性
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外源基因表达蛋白的积累对大肠杆菌生长的影响
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作者 王玉霞 宁秀丽 王春梅 《药物生物技术》 CAS 2013年第6期491-495,共5页
探讨外源基因表达蛋白的积累对大肠杆菌生长的影响规律。构建人粒细胞集落刺激因子和乙肝表面抗原基因的表达载体PET-30a-hG-CSF和PET-30a-HBsAg,采用比浊法,观察IPTG诱导前后野生型大肠杆菌BL21(DE3)、PET-30a转化菌、PET-30a-hG-CSF... 探讨外源基因表达蛋白的积累对大肠杆菌生长的影响规律。构建人粒细胞集落刺激因子和乙肝表面抗原基因的表达载体PET-30a-hG-CSF和PET-30a-HBsAg,采用比浊法,观察IPTG诱导前后野生型大肠杆菌BL21(DE3)、PET-30a转化菌、PET-30a-hG-CSF转化菌、PET-30a-HBsAg转化菌的生长规律;Western-blotting方法验证hG-CSF的特异性表达,ELISA方法验证HBsAg的特异性表达,SDS-PAGE方法表征hG-CSF和HBsAg蛋白的表达量。结果:空载体PET-30a质粒会使宿主菌的生长速率降低,而质粒PET-30a-hG-CSF或PET-30a-HBsAg却对宿主菌生长影响不大;PET-30a-hG-CSF转化菌诱导后hG-CSF蛋白的表达量随着宿主菌的生长而积累,但宿主菌的生长速度随着蛋白的积累而减缓。外源基因表达蛋白的积累减缓宿主菌的生长。 展开更多
关键词 大肠杆菌bl21(de3) 生长 载体PET-30a 人粒细胞集落刺激因子 乙肝表面抗原 外源蛋白积累
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重组BbFGF工程菌的发酵条件(英文) 被引量:1
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作者 熊盛 林剑 +4 位作者 姚汝华 刘杰森 张玲 张美英 李志英 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2001年第4期53-58,共6页
利用大肠杆菌BL2 1(DE3) pLysS生产重组牛碱性成纤维细胞生长因子 (BbFGF) ,对此工程菌的发酵条件进行了研究 .在前期试验的基础上 ,重点探索培养基、诱导剂及葡萄糖添加方式对T7启动子指导下的bFGF合成的影响 .根据摇瓶试验和分批发酵... 利用大肠杆菌BL2 1(DE3) pLysS生产重组牛碱性成纤维细胞生长因子 (BbFGF) ,对此工程菌的发酵条件进行了研究 .在前期试验的基础上 ,重点探索培养基、诱导剂及葡萄糖添加方式对T7启动子指导下的bFGF合成的影响 .根据摇瓶试验和分批发酵试验结果 ,建立了一套变速流加葡萄糖的高密度补料分批发酵工艺 .在此工艺下 ,经 11h发酵 ,可得光密度为 30 .7、bFGF产量为 95mg/L的发酵产物 .两步法纯化目的蛋白 ,得到纯度为 95%的重组bFGF ,其生物活性和标准品一致 . 展开更多
关键词 大肠杆菌bl21(de3)plyss T7启动子 补料分批发酵 牛碱性成纤维细胞生长因子 工程菌 发酵工艺 培养基 BbFGF
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