增强型绿色荧光蛋白在DH5α大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从pEGFPpA-CAN克隆载体中扩增出增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP),插入到pGEM-Teasy载体中,构建pGT-EGFP重组质粒,其中的SP6启动子可用来表达EGFP蛋白。携带pGT-EGFP重组载体的DH5α大肠杆菌较普通DH5α大肠杆菌菌液略带淡绿色,在荧光显微镜下能够清晰观察该大肠杆菌的形态,带有绿色荧光。同时超声裂解携带pGT-EGFP重组载体的DH5α大肠杆菌,提取菌体总蛋白,SDS-PAGE显示EGFP蛋白是以可溶性蛋白形式存在的,分子质量大约为30kD,与其理论值大小一致。

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨

目的探讨影响大肠杆菌DH5a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素。方法于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞。在电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率。结果于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高达1.01×1010CFU/μg DNA。结论该法适合于大肠杆菌DH5a,可获得较高的转化效率。

基于绿色荧光蛋白的冷鲜猪肉中大肠杆菌预测模型的构建

为了预测和监控冷鲜猪肉储存过程中腐败细菌大肠杆菌的变化规律,评估产品货架期,建立微生物生长预测模型。该研究将绿色荧光蛋白质粒pGFP转入大肠杆菌DH5α,构建GFP的标记大肠杆菌。基于绿色荧光蛋白报告基因和氨苄青霉素抗性,采用稀释平板法定量追踪检测0~24℃条件下冷鲜猪肉中DH5α生长变化。采用Gompertz模型、平方根模型和响应面方程进行数据拟合,构建数学预测模型。结果表明Gompertz模型拟合效果良好,0~20℃条件下决定系数R^(2)为0.96~0.99。温度与最大比生长速率平方根、延迟期倒数平方根模型R^(2)分别为0.862、0.948。响应面模型揭示时间、温度对大肠杆菌的生长影响显著(P<0.05),二者交互作用明显,响应面模型R^(2)为0.815。模型能够有效拟合冷鲜猪肉中与温度、时间相关的大肠杆菌的生长变化规律,研究结果为产品储存过程中细菌变化预测提供理论依据。

大肠杆菌数量动态变化体系的探究

利用重组大肠杆菌DH5α生长曲线的检测来构建关于"种群数量动态变化"实验体系,通过比浊法和稀释平板菌落计数法,加上琼脂凝胶检测辅助,可严谨地保障实验结果的准确性。实验结果表明,重组大肠杆菌DH5α的生长规律符合细菌的生长规律;而大肠杆菌相对于酵母,更加简便和节约时间;对于学生实验来说,可操作性更强。

表达于工程菌 DH5α 中 Taq DNA 聚合酶的纯化

采用聚乙烯亚胺沉淀、ＢｉｏＲｅｘ７０离子交换、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、ＰＣＲ检测等简单方法，在３０ｈ内完成ＴａｑＤＮＡ聚合酶的基因重组质粒在工程菌ＤＨ５α中超表达酶的提取纯化及酶活标定。２０００ｍｌ发酵液可提纯３万Ｕ的ＴａｑＤＮＡ聚合酶，与国外优质产品（ｐｒｏｍｅｇａ）相比，热稳定性没有差别，扩增特异性尚需进一步探讨。

提高重组质粒转化E. coli DH5α方法的研究

研究了质粒载体和外源DNA的浓度、酶切体系的酶切时间以及酶切产物的链接时间对转化效率的影响。结果表明,当pUC19质粒载体的浓度为25ng/μL,外源基因λDNA的浓度为100ng/μL,酶切时间3h,且连接时间为14h时,构建出的重组质粒转化大肠杆菌DH5α效率最高。

重组大肠杆菌DH5α生长曲线的测定

为了探讨重组大肠杆菌适宜的培养时间,试验将携带质粒的重组大肠杆菌DH5α单菌落液体培养至OD600值为0.6左右,按一定比例接种于LB液体培养基中进行培养,分别在0,1.5,3,4,6,8,10,12,14,16,18,20小时时取菌液,用分光光度计测定OD600值,以培养时间为横坐标、OD600值为纵坐标作重组菌生长曲线图,同时提取质粒比较不同培养时间质粒量的变化。结果表明:重组大肠杆菌DH5α的生长经历了迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期4个时期,符合细菌生长的规律;重组大肠杆菌生长至平台期时提取质粒的量最多。

基于大肠杆菌受体菌DH5α △asd缺失株的构建及作为基因转化、表达操作系统的评估

基于大肠杆菌(E.coli)染色体上asd基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建E.coliDH5α的asd基因缺失突变株DH5α△asd::cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20介导二次同源重组,以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合PCR扩增和测序结果,证明DH5α△asd缺失突变株的正确构建。该缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力,只有添加DAP或导入表达asd基因的质粒(asd基因互补试验)才能在LB培养基上生长,与原型DH5α比较,其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致。基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统。体外培养连续传代50代次,pnirBMisL-fedF-asd质粒不丢失,并功能性表达F18大肠杆菌黏附素FedF。

产异丁醇关键基因在大肠杆菌中表达的研究

【目的】改造大肠杆菌缬氨酸合成途径,使其能够代谢合成异丁醇。【方法】将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)1.2829的2-酮异戊酸脱羧酶基因(kivD)和醇脱氢酶基因(adhA)串联克隆到大肠杆菌DH5α宿主中表达。【结果】经过改造的宿主菌发酵24 h后异丁醇产量为0.12 g/L。酶活测定实验发现,kivD和adhA基因在宿主菌中均得到表达,但由于KivD的低表达量导致宿主菌最终的异丁醇合成能力偏低。通过研究温度和pH对KivD和AdhA酶活的影响,最终选定二者的最适温度为30°C,最适pH为6.5。【结论】通过向宿主菌导入外源异丁醇合成基因能够改造其自身代谢途径,从而合成异丁醇。

应用糖基化碳量子点研究甘露糖与致病菌之间的相互作用

以柠檬酸为碳源,通过水热法制备得到荧光碳量子点(CQDs),基于其表面的—COOH,将4-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷以共价键的方式固定在CQDs表面,得到甘露糖基化碳量子点(Man-CQDs),并通过荧光竞争法,结合Scatchard方程计算了Man-CQDs与大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5a和沙门氏菌S.123443的结合常数Ka。实验得到CQDs的粒径为26 nm,最大发射波长为445 nm,荧光产率相较于54%硫酸奎宁为76%,Man-CQDs荧光强度与CQDs相比基本保持不变,通过苯酚-硫酸法计算得到Man-CQDs浓度为2.832 mmol/L,Man-CQDs纳米颗粒中甘露糖含量约为40%。根据Man-CQDs、D-Mannose与致病菌竞争结合实验,结合Scatchard模型方程,计算得到Man-CQDs与大肠杆菌JM109的结合常数Ka=2.39×103L/mol,Man-CQDs与沙门氏菌S.123443的结合常数Ka=1.17×105L/mol,Man-CQDs与大肠杆菌DH5a无有效结合。研究结果显示,该方法可用于甘露糖与致病菌非共价结合的结合常数测定,为研究糖与致病菌相互作用提供了参考。

影响人α-突触核蛋白基因在原核细胞中表达因素的研究

目的 研究影响人α 突触核蛋白 (α synuclein)基因在原核细胞中表达的常见因素 ,以提高其在原核细胞中的表达量。 方法 将重组质粒ProEXNACP转化进入到DH5α 大肠杆菌体内 ,观察诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导培养基、诱导初始菌浓度及诱导中pH值变化等因素对蛋白表达产量的影响 ,用SDS PAGE梯度胶电泳分析 ,考马斯亮蓝染色进行比较研究 ,同时检测pH值 ,观察其变化。 结果 诱导剂IPTG浓度对诱导蛋白产生的影响不大 ,诱导过程中pH值变化较小 ,而诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类对诱导产生α 突触核蛋白有较大影响。其中 ,以LB培养基 ,37℃ ,180r min诱导 1～ 2h产生α 突触核蛋白的量最大。 结论 诱导剂IPTG诱导ProEXNACP/DH5α大肠杆菌产生α 突触核蛋白的量与诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类有明显的关系。初始菌A590 =0 5～ 0 8,LB培养基 ,37℃ ,大通氧量 (180r min以上 ) ,1～ 2h诱导可作为大量提取、纯化α 突触核蛋白的首选条件。

漠黄梅共生菌藻宏基因组文库的构建

为了从耐旱地衣漠黄梅的共生菌藻基因组中筛选功能基因,并为蛋白质类药物的基因筛选提供平台,采用改进的CTAB方法提取其总DNA,用Sau3AⅠ限制性内切酶部分酶切基因组DNA,以质粒pUC19为载体,转入大肠杆菌DH5α中,构建了漠黄梅共生菌藻的宏基因组文库。该文库包含了4.8×105个重组子,插入片段的平均大小为4kb,覆盖漠黄梅菌藻的整个基因组4次。

GOD转基因酵母菌的构建及其重组GOD的纯化与活性分析

葡萄糖氧化酶（GOD）被广泛应用于食品工业、医学诊断试剂等。目前葡萄糖氧化酶生产主要采用的发酵体系，大多数属于胞内表达存在生产成本偏高，且产出蛋白有杂质使产品纯度不够高等问题。因此，如何构建优良的GOD产生菌株，并让它有效的高表达，具有重要意义。本实验用Sacl内切酶鉴定所保存的质粒是否正确，克隆的真核分泌型表达载体质粒pPIC9K—His—GOD转化大肠杆菌，提取重组质粒pPIC9K—His—GOD并纯化质粒。用pPIC9K—His—GOD用BlgII内切酶线性化，电转毕赤酵母菌GS115，用PCR法鉴定其基因组中是否转化成功。将得到的预期菌种做发酵表达，SDS-PAGE检测蛋白表达结果。