过量表达烟酸转磷酸核糖激酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111厌氧发酵的主要产物为丁二酸,是发酵生产丁二酸的潜力菌株。但是由于敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因(pflB),导致辅酶NADH/NAD+不平衡,厌氧条件下不能利用葡萄糖生长代谢。构建烟酸转磷酸核糖激酶的重组菌Escherichia coli NZN111/pTrc99a-pncB,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加0.5 mmol/L的烟酸、0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的烟酸转磷酸核糖激酶(Nicotinic acid phosphoribosyl transferase)酶活较出发菌株提高了11倍,辅酶NAD(H)的总量提高了3.85倍,特别是NAD+的浓度提高了5.17倍,NADH/NAD+的比例从0.640下降到0.125,使重组菌株在厌氧条件下具有生长和代谢葡萄糖的能力。

过量表达苹果酸脱氢酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的工程菌,厌氧条件下由于辅酶NAD(H)的不平衡导致其丧失了代谢葡萄糖的能力。构建了苹果酸脱氢酶的重组菌大肠杆菌NZN111/pTrc99a-mdh,在厌氧摇瓶发酵过程中通过0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase,MDH)酶活较出发菌株提高了14.8倍,NADH/NAD+的比例从0.64下降到0.26,同时NAD+和NADH浓度分别提高了1.5倍和0.2倍,厌氧条件下重组菌株具有生长和代谢葡萄糖的能力。采取两阶段发酵,有氧培养至细胞干重6.4 g/L,转厌氧后15 h,葡萄糖消耗14.75 g/L,丁二酸浓度达到15.18 g/L,丁二酸的得率为1.03 g/g葡萄糖,丁二酸的生产强度为1.012 g/(L.h)。

过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的发酵生产丁二酸的潜力菌株。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。nadD为催化NAD(H)合成途径中烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase,NAMNAT)的编码基因,通过过量表达nadD基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+比例。文中构建了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD中NAD+和NADH的浓度分别比宿主菌E.coli NZN111提高了3.21倍和1.67倍,NAD(H)总量提高了2.63倍,NADH/NAD+从0.64降低为0.41,使重组菌株恢复了厌氧条件下生长和代谢葡萄糖的能力。重组菌与对照菌相比,72 h内可以消耗14.0 g/L的葡萄糖产6.23 g/L的丁二酸,丁二酸产量增加了19倍。

果糖和麦芽糖作为有氧碳源对大肠杆菌NZN111两阶段发酵中厌氧发酵的影响

为了了解磷酸转移酶转运系统(PTS)依赖和非PTS依赖代谢的糖类对大肠杆菌生产琥珀酸的影响,进行了两阶段培养,有氧阶段采用PTS依赖型的果糖或非PTS依赖型的麦芽糖作为丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和乳酸脱氢酶(LDH)双突变株NZN111的碳源,研究其对NZN111厌氧阶段代谢葡萄糖的影响。5 L罐发酵结果表明,以果糖和麦芽糖为碳源有氧培养的细胞恢复了在厌氧条件下快速代谢葡萄糖的能力,琥珀酸和丙酮酸成为主要代谢产物,最终琥珀酸得率分别为0.84和0.75 mol/mol,丙酮酸得率分别达到了0.65和0.83 mol/mol,琥珀酸和丙酮酸终浓度比分别为1.73∶1和1.21∶1。果糖和麦芽糖培养的NZN111与葡萄糖培养的菌体代谢的明显差异推测是cyclic AMP(cAMP)依赖型和非cAMP依赖型的分解代谢物阻遏调控这两种机制共同作用的结果。

使用大肠杆菌0_(111)诱导小鼠腹泻模型

目的:为临床研究提供腹泻病动物模型。方法:使用致病性大肠杆菌0111菌株,通过腹腔注射和经口灌胃两种途径感染小鼠。结果:经腹腔注射,可诱导小鼠腹泻,大便培养阳性,半数致死量为3.0亿/只,半数致腹泻量为2.4亿/只;经口灌胃30亿/只,小鼠未致端正。结论:经腹腔注射致病性大肠杆菌0111菌株可诱导出小鼠腹泻模型。

冻干奶粉样品中大肠杆菌O157和O111的检测方法

应用实时荧光PCR技术建立一种检测冻干奶粉样品中大肠杆菌的方法。通过传统培养法将大肠杆菌O157和O111分离纯化,根据大肠杆菌O157和O111的两对特异性基因rfbE和wbdl设计引物和探针,进行RT-PCR检测;由于该大肠杆菌可能是产志贺毒素大肠杆菌,对STEC的特异性毒力基因stx1、stx2b、eae设计引物和探针并检测。结果表明,该冻干奶粉样品中含有大肠杆菌O157和O111,且致病菌O157检出毒力基因stx1、stx2b、eae,即产志贺毒素与黏附素,致病菌O111检出毒力基因eae,不产志贺毒素而产黏附素。该方法能准确分离大肠杆菌O157和O111,利用实时荧光PCR的高灵敏度和特异性快速检验致病菌及其特异性毒力基因。

重组大肠杆菌厌氧发酵产丁二酸培养条件的优化

采用Plackett-Burman设计法(Plackett-Burman,PB)对影响Escherichia coli NZN111(sfcA)厌氧发酵生产丁二酸的11个因子进行了筛选。结果表明,影响该菌厌氧发酵生产丁二酸的主要影响因子为乙酸钠、MgCO3、接种量、诱导剂IPTG加入时间和发酵周期。在此基础上采用响应曲面法(Response Surface Methodology,RSM)对这5个因子的影响进行了研究,得出多元二次回归方程拟合的5种因素与丁二酸产量间的函数关系,并根据优化结果与实验验证,当初始葡萄糖浓度为22 g/L,乙酸钠1 g/L,MgCO317 g/L,接种量10%,IPTG初始时加入,发酵周期76 h时,丁二酸产量从原始发酵培养条件下的11.84 g/L提高到15.64 g/L,收率从53.8%提高到71.1%。

抗内毒素核心糖脂抗体大肠杆菌J5株免疫血清的制备

目的 探讨制备高效价抗内毒素核心糖脂 ( E.Coli J5 )抗体 ,为免疫治疗革兰阴性菌 ( GNB)菌血症和感染性休克奠定基础。方法 应用大肠杆菌 O111:B4变异株 ( J5 )制备无毒菌苗 ( 5 0× 10 1 2 / L )。12只家兔经耳缘静脉注射 J5菌苗 (另 12只用生理盐水作对照 ) ,每 3d注射 1次 ,共 5次 ,每次剂量依次为 0 .1、0 .2、0 .4、0 .6和 0 .8ml。第 5次注射后 1周由心脏取血 4 0～ 5 0 m l,分离血清 ,采用间接血凝法测定抗体效价及交叉反应试验。结果 12只免疫家兔中 ,6只抗体效价在 1∶ 10 2 4以上 ,并与多种 GNB内毒素产生交叉反应。结论 自制的 E.Coli J5抗体效价高 ,可与多种

重组大肠杆菌利用蔗糖及糖蜜发酵生产丁二酸

富含蔗糖的甘蔗糖蜜可作为制备丁二酸的廉价原料。然而生产丁二酸的潜力菌株大肠杆菌Escherichia coli AFP111不能代谢蔗糖。为了使其具有蔗糖代谢能力,将E.coli W中非PTS蔗糖利用系统蔗糖通透酶的编码基因csc B,果糖激酶的编码基因csc K和蔗糖水解酶的编码基因csc A克隆并表达到AFP111中,获得重组菌株AFP111/p MD19T-csc BKA。经厌氧发酵验证,重组菌株72 h消耗20 g/L蔗糖,丁二酸产量达到12 g/L。在3L发酵罐中采用有氧阶段培养菌体、厌氧阶段发酵的两阶段发酵方式,厌氧发酵30 h,重组菌株以蔗糖和糖蜜为碳源丁二酸产量分别为34 g/L和30 g/L。结果表明,通过外源引入非PTS蔗糖利用系统,重组菌株具有较强的代谢蔗糖生长及合成丁二酸的能力,并且能够利用廉价糖蜜发酵制备丁二酸。

产丁二酸工程菌的构建及其厌氧发酵

为了考察过量表达苹果酸酶对于E.coli NZN111(IdhA::Kan pfl::Cam)厌氧发酵产丁二酸的影响,将连接有苹果酸酶基因sfcA的表达载体pTrc99a-sfcA转化进NZN111中,构建了重组NZN111(pTrc99a-sfcA)。0.5 mmol/LIPTG诱导8 h后,测定的苹果酸酶比酶活为30.67 u/mg,比受体菌提高了140倍。采用两阶段发酵模式,结果表明:过量表达的苹果酸酶在NZN111体内催化了从丙酮酸到苹果酸的逆向反应,丁二酸是发酵过程中积累的主要有机酸,且当加入0.7 mmol/L IPTG诱导,初始葡萄糖糖浓度为18.5 g/L时,选择对数生长期后期的菌种以10%的接种量转入厌氧发酵,发酵结束时发酵液中丁二酸的浓度为12.84 g/L,对葡萄糖的收率为69.43%,乙酸为0.58 g/L,二者浓度比为22:1,没有检测到甲酸和乳酸。构建的菌种具有高产丁二酸和副产物极少的优点,在同类菌种中处于先进水平。

小鼠细菌性腹泻模型的诱导方法

目的 :诱导小鼠细菌性腹泻模型。方法 :使用致病性大肠杆菌 O1 1 1 菌株 ,途径为腹腔注射和经口灌胃。结果 :经腹腔注射 ,可诱导小鼠腹泻 ,大便培养阳性 ,半数致死量为 3 .0亿 /只 ,半数致腹泻量为 2 .4亿 /只。经口灌胃 3 0亿 /只 ,小鼠未致病。结论 :经腹腔注射致病性大肠杆菌 O1 1 1 菌株可诱导出小鼠腹泻模型。