大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC的结构特性及刺激Caco-2细胞作用的研究

试验旨在分析大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白FliC(FliC_(EcN))的结构特征及其对Caco-2细胞的刺激作用。试验通过大肠杆菌BL21(DE3)表达FliCEcN蛋白、经NTA柱纯化FliC_(EcN)蛋白并通过SDS-PAGE和Westernblot验证,利用SOPMA和Alphofold2预测FliC_(EcN)蛋白的结构模型、表面增强拉曼光谱和圆二色谱解析FliC_(EcN)蛋白的结构,使用FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞后,检测免疫相关因子的分泌水平。结果显示,FliC_(EcN)蛋白的大小为64kDa,能够被抗His单克隆抗体特异识别;FliC_(EcN)蛋白的氨基和羧基末端主要由α-螺旋组成,中间结构域主要由β-折叠组成。FliC_(EcN)蛋白酰胺Ⅰ区最大吸收峰均位于1656 cm^(-1)处,主要二级结构为α-螺旋和β-折叠;FliC_(EcN)的α-螺旋占比44.4%,β-折叠占比23.4%,β-转角占比13.5%,无规则卷曲占比19.0%;FliC_(EcN)蛋白能够有效刺激Caco-2细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10);随着刺激时间延长,IL-6的分泌水平呈下降趋势,IL-10和TNF-α的分泌水平呈增加趋势。研究表明,α-螺旋和β-折叠是构成FliC_(EcN)的主要结构,可促进其构象的正确折叠和维持其三维结构稳定,FliC_(EcN)蛋白刺激Caco-2细胞分泌IL-6、IL-10、TNF-α的水平存在差异。

大肠杆菌Nissle 1917对炎症性肠病治疗作用的研究进展

炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组特定的肠道疾病的统称,主要体现为慢性及复发性的肠道炎症。其全球发病率正在迅速上升,严重影响人们生活质量与生命健康,已成为当前的全球性健康问题。在过去的几十年里,大量研究表明IBD的发病率与肠道菌群失调有关。因此,以肠道益生菌为主的治疗策略成为一大热点,其中大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)备受关注。本文聚焦肠道益生菌EcN在治疗IBD中的应用与机制,系统地综述了EcN的益生菌特性,概述EcN在临床实践中对IBD的治疗应用,同时从上皮屏障完整性调节、免疫调节、黏液屏障保护和肠道菌群稳态等方面阐述EcN治疗IBD的具体作用机制。此外,结合当前的研究现状,讨论了未来基于工程化EcN新疗法的发展前景,强调EcN在IBD治疗和预防中的适用性和可行性策略,并对该领域未来的研究方向进行了展望,为进一步深入研究EcN治疗IBD提供思路和参考。

益生菌大肠杆菌Nissle 1917抗逆性能、猪肠上皮细胞黏附率及抑菌效果研究

本试验旨在研究益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Ec N)抗逆性能、猪肠上皮细胞黏附率及抑菌效果。采用体外法对Ec N进行生长曲线绘制和耐酸、耐胆盐、耐热性能的测定;以猪肠上皮细胞IPEC-J2细胞为体外细胞模型,考察了Ec N对该细胞的黏附率以及对致病菌大肠杆菌K88的黏附抑制率;同时通过蛋白质印迹法检测了Ec N对IPEC-J2细胞β-防御素-2和Toll样受体4的水平的影响。结果表明:1)Ec N对高酸、高胆盐和高温环境具有一定耐受能力。2)Ec N对IPEC-J2细胞的黏附作用以对数期最佳,黏附率达33.96%,显著高于迟缓期、稳定期和衰亡期(P<0.05)。3)Ec N对致病菌大肠杆菌K88具有良好的抑制效果,黏附抑制率达87.84%。4)Ec N还能上调IPEC-J2细胞β-防御素-2和Toll样受体4水平。结果提示,益生菌Ec N具有较好的抗逆性能,能够良好地黏附猪肠上皮细胞,对致病菌大肠杆菌K88具有良好的抑制作用。

大肠杆菌Nissle 1917株鞭毛展示6His标签的构建及相关生物学特性分析

为探索大肠杆菌Nissle 1917株(EcN)鞭毛展示的应用,本研究以重组质粒p UC18-fli C为模板,反向PCR产物经DpnⅠ、Exnase^(TM)Ⅱ重组环化,将6His标签基因分别插入无质粒大肠杆菌Nissle 1917(EcNcured of its two cryptic plasmids p MUT1和p MUT2;EcNc)fli C高变区774 bp^775 bp和792 bp^811 bp之间,构建嵌合鞭毛基因片段fliC01和fliC02。分别将其克隆于自杀性载体pRE112中,构建重组质粒pRE112-fliC01和pRE112-fliC02,并分别转化至EcNc中。通过一次重组和二次重组将嵌合鞭毛基因整合于EcNc基因组中,构建无抗性筛选的重组菌株EcNc fliC01和EcNc fliC02。对重组菌株进行生长状况、鞭毛形成以及体外细胞黏附试验和小鼠体内定植试验检测,结果表明EcNc fliC01和EcNc fliC02的生长未受影响,表达的嵌合鞭毛能够被H1多抗或His-Tag单克隆抗体识别并组装形成鞭毛丝;重组菌对IPEC-J2细胞的黏附能力及小鼠肠道定植能力与亲本株EcNc相比无显著性差异。本实验结果为进一步研究EcNc鞭毛展示技术应用于活疫苗研制奠定了基础。

大肠杆菌Nissle 1917鞭毛蛋白部分高变区功能初步研究

初步研究大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle 1917,EcN)鞭毛蛋白(Flagellin,FliC)高变区的功能,为探讨其作为表面展示系统的可行性打下基础。以EcN无质粒克隆(EcN was cured of its 2 cryptic plasmids pMUT1 and pMUT2 resulting in EcNc)为实验菌株,分别构建2个鞭毛蛋白基因(fl iC)高变区859-888位、829-858位的缺失突变株和回补菌株。分析突变区域对EcNc的生长性能、生化特性、运动性及抗原性等方面的影响。结果显示:EcNc、两个缺失株和回补株的生长特性无明显差异,且三者生化试验结果一致。缺失突变株在半固体培养基上不能运动,而回补株均恢复了原运动性;缺失突变株均不与H1单因子血清发生凝集,而互补菌株均能产生与EcNc一致的凝集反应。表明高变区的这两个区域尽管不影响菌株的生长性能和生化特性,但与EcN的运动性及抗原性密切相关。这为进一步探索EcN鞭毛展示技术的研究提供了一定的数据。

大肠杆菌Nissle 1917与肠屏障功能的研究进展

革兰氏阴性菌大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN)是一种非乳酸类益生菌。研究发现,EcN能长期稳定定殖于肠道,与肠上皮细胞及肠道其它微生物相互作用,发挥生物学效应。肠道屏障功能是维持肠道正常生理的重要机制,屏障功能的受损与多种疾病相关,寻求对肠道屏障功能有维持和修复作用的物质,是治疗诸多相关疾病的重点突破口。既往的研究发现,EcN对屏障功能有一定的保护作用,本文将从EcN对肠屏障功能的保护作用的产生机制方面进行系统文献综述。

大肠杆菌Nissle 1917菌株荚膜多糖合成基因kfiA的功能研究

[目的]分析益生菌EcN的荚膜多糖合成基因簇,寻找致病性大肠杆菌K5菌株的肝素前体多糖替代来源。[方法]通过基因敲除、基因回补、1H核磁共振(NMR)检测等技术手段,研究了kfiA基因在EcN荚膜多糖合成过程中的功能。[结果]利用λ-red重组系统成功构建了kfiA突变株,利用NMR检测发现kfiA缺失突变株的荚膜多糖特征峰消失,又通过染色体重组技术,把kfiA基因插入了EcN突变株的基因组中,核磁共振检测重新发现了荚膜多糖特征峰。[结论]kfiA基因是EcN菌株荚膜多糖合成途径的一个关键基因,参与了荚膜多糖合成。λ-red重组系统与染色体重组技术同样适用于EcN菌株,可为后续的菌株改造提供参考。

噬菌体P1侵染大肠杆菌Nissle 1917(EcN)机理研究

[目的]找出噬菌体侵染大肠杆菌的位点。[方法]选择血清型为O6∶K5∶H1的大肠杆菌Nissle 1917(Ec N)作为试验菌株。通过λ-RED系统,突变其K抗原和O抗原合成基因,通过检测P1转导至这一系列突变株的转导效率来确定P1的侵染位点。[结果]双突变株Ec NΔkfi AΔwaa G::Cm具有最高的转导效率。kfi A基因突变导致了K抗原缺失,waa G基因突变导致了LPS核心寡糖中第2位庚糖(HepⅡ)的暴露,使得P1更容易接触到HepⅡ,从而侵染细菌。[结论]研究认为HepⅡ很可能就是噬菌体P1的识别位点。

金属抗菌肽SIF_(4)对大肠杆菌拓扑异构酶活性及胞内核酸合成的影响

为系统阐明金属抗菌肽SIF_(4)基于DNA拓扑异构酶靶点的非细胞质膜抑菌机理,以大肠杆菌为模式菌株,研究了金属抗菌肽SIF_(4)与基因组DNA的结合方式、对DNA拓扑异构酶I/II活性以及胞内核酸生物合成的影响机理。研究发现,金属抗菌肽SIF_(4)可能以类似溴化乙锭嵌插方式与基因组DNA结合,对拓扑异构酶I有较强抑制活性,但对拓扑异构酶II影响较小,可通过影响DNA负超螺旋解链和RNA聚合酶结合催化RNA转录过程发挥抑菌活性。研究还发现,经金属抗菌肽SIF_(4)处理12 h后,大肠杆菌胞内总DNA和总RNA生物合成量均受到不同程度的抑制,且呈现良好的量-效关系,1/2最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)组与对照组(0 MIC)相比,胞内DNA和RNA生物量差异不显著(P>0.05),MIC和2 MIC组与对照组相比,胞内DNA和RNA生物量差异显著(P<0.05)。实验结果可为金抗肽SIF_(4)在食源性大肠杆菌生物防控中的应用提供理论支持。

大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达

菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因,实现其高效表达,为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因,将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养,通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株,同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计,以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达,经SDS-PAGE和WB双重验证后,确立最佳诱导条件,最终纯化出目标酶蛋白。结果表明:(1)成功克隆SDB2多酚氧化酶基因,构建出异源表达重组菌株。(2)克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个,总编码氨基酸263个(含标签氨基酸20个),氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0,理论等电点为6.94,据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。(3)确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃,IPTG浓度1 mmol,该条件下表达出大量可溶性酶蛋白,有利于工业化生产。本试验条件下,大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达,为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。

湖南省部分地区禽致病性大肠杆菌分离鉴定及生物特性分析

为探究湖南省禽致病性大肠杆菌的生物特性,从部分地区规模肉鸡场采集122份病死鸡临床肝脏样品,采用传统细菌培养方法进行分离培养和初步鉴定,利用大肠杆菌持家基因phoA进行PCR扩增,对纯化鉴定后的分离株进行血清型鉴定、种系发育群检测、多位点序列分型(MLST)、毒力基因检测、动物致病性试验及耐药性分析。结果显示:共分离出83株禽致病性大肠杆菌,鉴定出15种血清型,其中O2、O1、O78、O14为优势血清型,种系发育群分为B2、B1、A和D群,高致病性株主要来自B2、B1群;MLST分析共得到12种ST型,其中ST95、ST481、ST350为主要ST型;分离株irp2、fyuA、iutA、fimC毒力基因携带率为100%,其中38.55%菌株同时携带irp2、afa、fyuA、iutA、hlyF、iss、papC、fimC毒力基因;雏鸡致病性试验检出高致病性菌株46株(55.42%)、中等致病性菌株31株(37.35%)、低等致病性菌株6株(7.23%);分离株对10种常用抗生素有不同程度耐药,其中对四环素和新生霉素耐药最严重,耐药率分别为96.38%和92.77%。结果表明,湖南省禽致病性大肠杆菌遗传关系整体复杂多态,且致病性较高,耐药广泛,提示该地区应加强对禽大肠杆菌病的防控。

尿路感染细胞实验中庆大霉素对尿路致病大肠杆菌的杀伤作用及细胞毒性研究

目的在尿路感染体外细胞实验中,比较不同浓度庆大霉素(0、10、20、50、100、200μg/mL)对尿路致病大肠杆菌(UPEC)的杀伤作用,对尿路上皮细胞及炎性细胞如巨噬细胞的毒性作用。方法比较不同浓度庆大霉素对不同量UPEC J96菌株(10^(8)、10^(7)、10^(6))的杀伤情况;CCK-8实验检测不同浓度庆大霉素在不同时间内(2 h或24 h)对原代培养的C57BL/6雄鼠肾小管上皮细胞、腹腔巨噬细胞、人膀胱上皮细胞系J82的毒性作用;根据实验选择合适的庆大霉素浓度和作用时间,检测J96对小鼠肾小管上皮细胞的黏附、入侵以及小鼠巨噬细胞对J96的吞噬、清除作用。结果庆大霉素(≥10μg/mL)对J96的杀伤作用均强于1%的青霉素/链霉素双抗(P<0.0001),高浓度庆大霉素(≥100μg/mL)可在30 min内完全杀伤高达10^(8)的J96。50μg/mL庆大霉素作用2 h可对人膀胱上皮细胞系J82产生毒性作用(P<0.05)。结论本文明确了不同细胞体外实验时适宜的庆大霉素处理浓度及时间,人膀胱上皮细胞系J82对庆大霉素更为敏感。

猪源大肠杆菌Nissle 1917菌株的分离鉴定

【目的】证实大肠杆菌Nissle 1917作为自然菌株存在于动物猪体内,并能从猪粪便中分离。建立大肠杆菌Nissle 1917的原位杂交鉴定方法。【方法】采集135份健康断奶仔猪的新鲜粪便制备DNA模板,以人源大肠杆菌Nissle 1917为阳性对照菌株,分别针对Nissle 1917的I型菌毛亚单位Fim A、F1C菌毛亚单位Foc A及两个质粒pMUT1和pMUT2的相关基因序列设计5对特异性引物进行PCR扩增;并将其中427 bp大小的质粒片段pMUT2(a)作为目的片段回收纯化,用地高辛随机引物标记法制成DNA探针。【结果】从其中的2份DNA模板中扩增出上述5对特异性引物PCR预期大小相符的片段,初步认为大肠杆菌Nissle 1917可能存在于猪体内。应用制备的探针通过菌落原位杂交的方法从2份阳性粪便样品中筛选出2株阳性菌落,通过血清学检验、PCR扩增和测序进一步鉴定为阳性Nissle 1917菌株。【结论】动物源益生菌Nissle 1917的分离鉴定,为优良动物源益生菌研究和应用奠定了基础。

大肠杆菌Nissle 1917隐秘质粒消除方法的建立

质粒消除旨在获得无质粒菌株,是对益生菌进行遗传改造所需的一项重要技术。本试验建立在质粒不相容性的基础上,引入自杀性载体pRE112作为辅助工具,使用分子生物学方法构建重组自杀质粒pMUT1-pRE112和pMUT2-pRE112,将其分别导入携带2个大隐秘质粒pMUT1和pMUT2的益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Escherichia coli Nissle 1917,EcN),利用重组自杀质粒去除EcN内原有隐秘质粒并在含有10%蔗糖的LB培养基上实施自杀质粒自身消除。结果试验成功获得EcN无质粒克隆菌株(Escherichia coli Nissle 1917cured of its two cryptic plasmids pMUT1and pMUT2,EcNc),为优质益生菌EcN更好的潜在应用研究奠定基础。

微酸性电解水-超声波并行联合处理对鲜切生菜表面大肠杆菌杀菌效果的影响

为探明微酸性电解水(slightly acidic electrolyzed water,SAEW)与超声波(ultrasonic,US)并行联合处理对鲜切生菜表面大肠杆菌(Escherichia coli)的杀菌效应,本研究在不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15(g/mL))和不同温度(25、35、45℃)条件下采用SAEW-US并行联合处理鲜切生菜,并用平板计数法测定生菜表面E.coli菌落数,对菌落数的变化情况进行协同效应分析及动力学分析。采用流式细胞术和双层培养计数法对处理后的E.coli进行亚致死损伤检测。结果表明,SAEW-US并行联合处理的杀灭E.coli效力高于SAEW单一作用时的杀灭E.coli效力,随着处理时间的延长、溶剂用量的增加和温度的提高,杀灭E.coli效果显著增强。SAEW-US并行联合处理对于杀灭E.coli具有“1+1>2”的协同效应,且杀菌过程遵循一级动力学模型。SAEW-US并行联合处理比单独SAEW处理杀灭E.coli效果强,并且能降低E.coli亚致死损伤数量。综上可知,SAEW-US并行联合处理鲜切生菜表面E.coli存在协同效应,相关结果可为鲜食农产品的杀菌提供理论依据。

山羊肺源肠外致病型大肠杆菌和粘质沙雷氏菌混合感染的病原分离鉴定、毒力因子基因检测和耐药性分析

为了确定1例成年山羊突然急性死亡的原因,本试验采用病史调查、病理剖检、病原菌分离和鉴定明确细菌性病原,对分离菌进行致病性试验和药敏试验,并根据药敏试验结果对其余未发病山羊进行给药预防;对分离到的大肠杆菌进一步进行系统进化群分析和毒力因子基因检测。结果显示,死亡山羊剖检可见部分结肠肠段严重出血,心内膜有散在出血斑,瘤胃黏膜局部充血;从肺组织中分离获得大肠杆菌和粘质沙雷氏菌;致病性试验结果显示,大肠杆菌对小鼠的致死率为90%,粘质沙雷氏菌对小鼠无致病性;药敏试验结果显示,大肠杆菌对头孢曲松和丁胺卡那敏感,粘质沙雷氏菌对恩诺沙星、丁胺卡那、庆大霉素和磷霉素中度敏感;使用头孢噻呋钠和恩诺沙星注射液对其余未发病山羊进行预防性注射给药后,未再出现发病死亡。系统进化群分析显示,分离获得的大肠杆菌属于A群;毒力因子基因检测结果显示,该大肠杆菌携带2种毒力标记基因(afa和iutA),因此属于肠外致病型大肠杆菌,该菌还携带其他毒力因子基因(ompA、ompT、traT、iss、iroN、iucD、fimH和gafD);本试验结果可为山羊大肠杆菌和粘质沙雷氏菌混合感染的诊断和治疗提供参考。

长颈鹿大肠杆菌感染引发出血性肠炎的治疗和护理

一头1岁10个月新引进长颈鹿,入园3个月出现大便稀软,接着出现稀便中带有血,寄生虫检测为阴性,细菌检验为大肠杆菌引起的出血性肠炎。经过及时治疗及精心护理,长颈鹿恢复健康。本次对长颈鹿的治疗和护理为长颈鹿的饲养管理提供一定的参考。

疑似鸡群发生霉菌毒素、念珠菌和大肠杆菌病混合感染病例

本文通过实例诊治一起主要表现为羽毛蓬松,拉灰白色或白绿色粪便、嗉囊食积液、眼睑等部位结痂临床症状,并进行病死鸡只剖检,肝、心、嗉囊和胃等器官主要呈现出现纤维素性、特征性坏死、溃烂等病症,诊断为霉菌毒素、念珠菌和大肠杆菌病混合感染,为及时有效选择敏感药采取普通营养琼脂培养基进行药敏试验,选用成品药敏纸片,根据结果采取治疗措施控制病情。通过本病例分析阐述,给予广大养殖户提高对真菌及毒素危害的认识。

复合酸化剂对大肠杆菌和沙门菌的体外抑菌效果探讨

随着饲料中禁止添加除中草药外的药物饲料添加剂,畜禽生产中消化道和呼吸道疾病的发病率普遍升高。药物投入增加和抗生素替代产品价格较高,导致饲养成本增加的问题凸显,高效绿色抗生素替代产品的寻找已成为畜禽业关注的重点。本文通过对鸡场中分离到的大肠杆菌和沙门菌进行复合酸化剂体外抑菌试验,研究复合酸化剂对常见细菌的杀灭和抑制效果,为在养殖业中的合理使用提供参考。

牛大肠杆菌病的防制措施

北票地区肉牛存栏增长很快,随着肉牛销售价格的坚挺,养牛户的积极性很高。但是在牛病防制方面,很多农户不是很重视,很多新养牛户错误认为牛体格大,疾病抵抗力强,不容易得病。随着养牛时间的增长,很多问题暴露出来,如有的牛感染大肠杆菌,新养牛户没有经验,往往因延误治疗而造成不必要的经济损失。1病原大肠杆菌是属于原核生物的一种细菌,属于革兰氏阴性细菌。大肠杆菌的细胞壁是由肽聚糖组成的,没有细胞核,只含有核糖体。大肠杆菌有鞭毛,无芽孢,能运动,能发酵多种糖类,通过分解糖类产气、产酸。大肠杆菌的菌落加入伊红美蓝,菌落有金属光泽,呈现深紫色,这种方法用来鉴定大肠杆菌存在与否。