兔抗大肠杆菌O157H7抗血清制备及鉴定

肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７Ｈ７主要引起出血性结肠炎并可引起溶血性尿毒综合征。近年来国外多次报道过该菌引起的暴发流行。患者死亡率较高，我国除个别地区国际海关检疫局检出该菌外，还未见报道。国外一些国家的疾病控制中心已规定医疗单位门诊及住院部细菌检测室应将该...

上转换免疫层析方法检测牛奶中大肠杆菌O157H7

免疫层析方法是最常见的快速检测方法之一,然而灵敏度低和基质耐受能力差限制了其在食源性致病菌检测中的应用。在本研究中,我们制备了上转换纳米材料(Upconversion Nanoparticles,UCNPs),并将其应用于免疫层析平台。由于UCNPs的反斯托克激发特性,所建立的方法能有效解决灵敏度差及机制耐受能力差的问题。通过系统性优化,所建立的免疫层析方法可在4.6×104 CFU·mL^-1~1×107 CFU·mL^-1浓度范围内实现定量检测,检测限为2.8×104 CFU·mL^-1。该方法在实际牛奶样本检测中表现出优良的抗基质干扰能力,其批内回收率为82.7%~105.4%,变异系数为5.8%~13.3%;批间回收率为79.4%~102.5%,变异系数为6.7%~7.5%。方法灵敏度较高,抗基质干扰能力强,不仅能用于大肠杆菌O157:H7的检测,也可被推广应用于其它食源性致病菌检测。

基于双球信号放大的大肠杆菌O157H7免疫HCR检测方法

快速准确的检测大肠杆菌O157:H7对食品安全及食源性疾病的早期诊治具有重要意义,免疫学检测方法具有特异性好、操作简便等优点成为最常见的快速检测方法之一,然而灵敏度低限制了其在食源性致病菌检测中的应用。研究将免疫学与HCR相结合建立一种免疫HCR方法检测大肠杆菌O157:H7,并采用双球策略规避了由于抗体与引发链同时标记在同一乳胶微球上存在相互干扰的问题,降低了抗体(mAb)对引发链的干扰,提高引发效率和检测方法的灵敏度。与基于单球的免疫HCR的灵敏度(2.7×10^3 CFU·mL^-1)相比,本方法中基于双球的免疫HCR的灵敏度(4.8×10^2 CFU·mL^-1)提高了5.6倍。

基于紫胶红素的靶标有色化免疫层析试纸条联检大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌

为摆脱免疫层析试纸条对配对抗体的依赖,文章设计了一种新型靶标有色化免疫层析试纸条,使用紫胶红素和十二合水硫酸铝钾媒染剂,通过先媒后染的方法,实现了免疫层析试纸条的“可视化”。验证结果显示,该试纸条对大肠杆菌O157∶H7和沙门氏菌的检测限均达到了106 CFU/mL;同时,与常见食源性致病菌间不存在交叉反应,在鸡胸肉、鸡蛋、牛奶等食品基质中能够在增菌9 h内检出。文章成功设计了一种操作简单、检测成本低,更易国产化的快速检测免疫层析试纸条,为后续免疫层析试纸条的设计提供了新思路。

食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测技术研究进展

近年来,因食源性致病菌造成的食品中毒正在不断增加,严重威胁了人类的健康,大肠杆菌(E.coli)O157∶H7由于其低感染剂量和高致病性等特点引起了研究人员和世界卫生组织的高度重视。因此精准快速的检测食品中的E.coli O157∶H7对食品安全问题有着重要的意义,是预防和控制食源性疾病传播的重要技术,为此本文对E.coli O157∶H7的常规检测方法、免疫学法、分子生物学法和其他方法进行论述,介绍了这些方法的优缺点,对各种方法进行了整体比较,以期为有关工作者在选择检测方法或研发新方法提供参考。

大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体SF08的分离、表征及在食品中的应用

本研究通过双层平板法从湖水中分离、纯化出一株大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体,并命名为SF08。对其生物学特性、基因组序列及在即食鸡爪中的抑菌效果进行分析。结果表明,SF08由长约124 nm的可收缩尾巴和直径约76 nm的多面体头部组成。最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)为0.01;潜伏期为20 min,裂解期为20~110 min,爆发量为66 PFU/cell;在pH 3~12和30~70℃条件下能保持较高的活性。基因组全长59704 bp,G+C含量为56.52%,共有72个开放阅读框(ORF)。SF08在4℃下可以极显著地抑制即食鸡爪中模拟污染的大肠杆菌O157:H7(P<0.01)。本研究表明SF08具有较好的生物学特性及安全性,为后续研发和制备天然杀菌剂提供理论基础和参考。

一种可快速检测大肠杆菌O157:H7的纸基传感器的制备与应用

大肠杆菌O157:H7是一种致病性较强的食源性细菌,通常在生制食品中被检出,一旦被人体摄入会引发肠道疾病,严重危害公众健康。本研究制备了功能化的长余辉探针,并结合适配体的特异性识别功能构建了能快速检测大肠杆菌O157:H7的纸基传感器,检出限达7.5×10^(3) CFU·mL^(-1)。该传感器可同时检测3个样品,具有特异性好、操作简便和环境友好的特点,可应用于大量样品中大肠杆菌O157:H7的快速筛查。

纳米金与纳米金花标记的免疫层析法的建立及快速检测大肠杆菌O157∶H7的比较研究

为实现大肠杆菌O157∶H7早期现场的快速检测,该试验通过化学还原法与介导生长法制备了AuNPs与AuNFs作为标记探针,建立2种用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测的免疫层析试纸条,并对2种试纸条的的灵敏度、特异性和准确性进行检测。结果显示,所建立的2种免疫层析方法均可在15 min内检出食品中的大肠杆菌O157∶H7,其中AuNP试纸条最低检出限为3.2×10^(5)CFU/mL,AuNFs试纸条最低检出限为3.2×10^(4)CFU/mL,与单增李斯特菌、沙门氏菌、坂崎肠杆菌等常见食源性致病菌没有交叉反应。对人工污染果冻、牛奶和牛肉等样品AuNPs试纸条分别在前增菌5、6、5 h时检出,AuNFs试纸条分别在前增菌5、5、4 h时检出,且不受食品复杂机制的影响。结果表明,所建立的2种免疫层析试纸条灵敏度高、特异性强、操作简便,适用于大肠杆菌O157∶H7现场快速检测。

基于抗体-适配体夹心生物传感器检测大肠杆菌O157:H7

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的与公共卫生相关的食源性病原体。抗体分子是体液免疫应答中最重要的效应分子,具有多种生物学活性,最主要的生物学功能是与相应抗原特异性结合。适配体是体外合成的较短DNA序列,可通过识别特定区域和靶标特异性结合。利用抗体和适配体的特异性识别功能及免疫磁珠的捕获作用和磁分离,并通过多克隆抗体和裁剪得到的适配体搭建生物传感器,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)可以实现对靶标在(8×10^(3))-(8×10^(6))CFU/mL范围内的定量检测,检测限为800 CFU/mL。

大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

本文采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金溶液标记大肠杆菌O157:H7抗体(6C1E5),然后将其包被于金标垫上,再将大肠杆菌O157:H7抗体(10G1A2)和兔抗鼠IgG分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,研制出的大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸检测灵敏度达104 CFU/mL,并与鼠寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌等8种菌株无交叉反应,显示出较强的特异性。

应用免疫磁珠法分离大肠杆菌O_(157)H_7

目的 :进一步探讨免疫磁珠法 (IMS)分离大肠杆菌 O1 5 7H7(E.O1 5 7H7)的敏感性。方法 :应用 IMS检测该菌的主要贮存宿主动物 (家禽、家畜 ) E.O1 5 7H7感染情况 ,同时用传统分离法作对照。结果 :家禽 (畜 )粪便中 E.O1 5 7H7分离率分别为鸡 2 .38% (2 / 84)、牛 9.5 2 % (4 / 42 )、猪 2 .41% (2 / 83) ,鸭、鹅、狗、驴和羊的粪便中未分离到 E.O1 5 7H7;传统法均未从上述家禽 (畜 )粪便中分离到 E.O1 5 7H7。结论 :据本次检测结果 ,表明 IMS分离 O1 5 7能提高检测的灵敏度 (检测水平为 2 cfu/ g,传统法为 2 0 0 cfu/ g) ,并缩短检测时间 1天 ,是开展 E.O1 5 7H7病原学分离 (包括人间和宿主动物的流行病学监测 )

辽宁地区猪源大肠埃希菌O157:H7的流行病学调查和耐药性分析

猪源大肠埃希菌O157:H7是一种新型的人畜共患致病性大肠埃希菌[1],可通过污染的牛肉、奶制品、蔬菜、水果等途径感染人类或畜禽。不仅严重危害生猪养殖业的发展,而且对人类的健康也构成巨大威胁,人感染后主要表现为腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等症状。众多动物食品污染源中,猪是其最重要宿主之一。本文从辽宁省9个地区的无害化处理厂、生猪养殖场和生猪屠宰场采集猪肛门拭子900份,进行大肠埃希菌O157:H7分离鉴定以及耐药性分析,为了解辽宁地区猪大肠埃希菌O157:H7的感染情况提供基础数据。

一株肠出血性大肠杆菌O_(157)H_7免疫奶牛实验即抗EHEC O_(157)H_7免疫乳的试制

用1株O157H7菌株和另外11株人类肠道主要病原细菌配制O157H7单菌疫苗和多菌联合多价疫苗,对荷斯坦牛进行免疫实验。对免疫常乳中抗EHEC O157H7特异性抗体凝集价进行了长期监测,并对受试奶牛的免疫反应、应激反应及疫苗对奶牛可能产生的毒性作用进行了观察。结果证明,疫苗免疫效果很好,所有奶牛在整个泌乳期一直保持较高的特异性抗体效价(滴度),均在27以上,下个泌乳期开始阶段也未见明显下降的迹象。本次实验意外发现约有30%的未进行过免疫注射的对照组乳样有较高的O157H7特异性抗体滴度,个别乳样凝集价高达27,这可能说明这些牛群中有较高的O157H7感染率或携带率。O157H7是人类近二十余年来才开始认识到的出血性结肠炎(HC)的主要致病菌,能造成出血性腹泻和其它严重并发症。是值得研究和重点防范的病原细菌。

不同方法检测食品中大肠埃希氏菌O157:H7/HM能力验证结果比较与分析

为提高实验室对食品中大肠埃希氏菌O157∶H7的检验检测能力,笔者单位参加了由中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中大肠埃希氏菌O157∶H7检测能力验证计划。此次实验采用国家标准《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157∶H7/NM检验》(GB 4789.36—2016)中的第一法和实时荧光PCR方法,分别对能力验证样品进行检测。结果显示,样品23-G520中未检出大肠埃希氏菌O157∶H7;样品23-F568中检出大肠埃希氏菌O157∶H7,结果反馈为满意。在能力验证实验中,不同检测方法同时使用、综合判断,能有效提高检测能力和结果的准确性。

中国科学院华南植物园揭示表达肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原的转基因生菜具有口服疫苗功效

出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种危害严重的食源性致病菌,能引发腹泻、出血性结肠炎,以及溶血性尿毒综合症等。该病原菌的宿主是以牛为主的反刍动物,可随宿主粪便排放到环境中,通过食物、水感染人类。面对EHEC O157:H7的感染,尚缺乏有效的治疗方案,给宿主接种疫苗则能较好地预防相关疾病暴发。鉴于EHEC O157:H7在动物粘膜表面定植,能激活粘膜免疫反应且成本低、使用方便的植物口服疫苗或能取代传统疫苗真正地走入市场。

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。

大肠杆菌O157∶H7微滴数字PCR定量方法的建立

以大肠杆菌O157∶H7（E.coli O157∶H7）rfb E基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR（dd PCR）方法。对dd PCR反应中的探针浓度进行了优化,考察了方法的线性范围、精密度、定量限和检出限。最终确定dd PCR反应中的最佳探针浓度为300 nmol/L。E.coli O157∶H7基因组DNA浓度范围为4-1.25×105拷贝/20μL dd PCR反应液时,dd PCR方法线性相关系数（R2）为0.999。当DNA浓度为760-88400拷贝/20μL时,方法的精密度最好（RSD〈5%）。本方法的定量限为4拷贝/20μL,检出限为3拷贝/20μL。特异性验证结果表明,建立的dd PCR方法特异性良好,对13份猪肉、牛肉和鸡肉样品的检测结果与定量PCR方法检出结果一致。

PCR法检测食品中大肠杆菌O157:H7

对大肠杆菌O157:H7型菌株的各毒力基因及基因组中的特异序列进行了设计和比对,确定292bp的检测引物。常规定性PCR和实时定量PCR证明该引物特异性强。模拟样品的前增菌实验结果表明本方法可以在原样品活菌浓度约2.0CFU/mL时通过16h增菌后检测出来,总的检测时间可以控制在24h内。本实验建立的PCR方法可用于食品中大肠杆菌O157:H7的快速测定。

上海地区家畜、家禽及肉制品大肠杆菌O157∶H7监测

目的 了解掌握本市家禽、家畜及肉制品大肠杆菌O15 7∶H7污染状况。方法 2 0 0 0年、2 0 0 1年分别在流行季节在设置的监测点与超市采集家禽、家畜粪便、肉类制品 ,应用常规培养法与免疫磁珠法进行监测。结果 两年间本市家禽、家畜及肉类制品O15 7∶H7阳性检出率 3 90 % ,阳性率最高为肉类制品 4 87% ,2 0 0 1年阳性率较 2 0 0 0年明显提高 (P <0 0 1) ,16种抗生素耐药性监测 ,不同来源菌株对 13种抗生素存在不同耐药率。结论 本市家禽、家畜及肉制品存在大肠杆菌O15 7∶H7污染状况 ,其中肉类制品高于家禽、家畜 ;免疫磁珠法阳性检出率高于常规培养法。

实时PCR在大肠杆菌O157∶H7快速检测中的应用

目的建立一种快速、敏感、特异的大肠杆菌O157∶H7的定量检测方法。方法根据GenBank公布的O157∶H7大肠杆菌rfbE基因序列,应用分子生物学软件进行序列比对,在该基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对荧光定量PCR反应条件进行优化,建立实时荧光定量PCR检测大肠杆菌O157∶H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。结果所有大肠杆菌O157∶H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1cfu/μL,重复性检测的变异系数均小于5%。在模拟污染牛奶中,可检出1×102cfu/μL的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3h。结论本研究建立的基于Taqman探针技术的实时PCR检测体系具有快速、灵敏度高、特异性强等优点,可用于大肠杆菌O157∶H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。