大肠杆菌T蛋白的高效表达和分离纯化

目的 构建高效表达菌株 ,以大量表达大肠杆菌T蛋白 ,为后续的新药作用靶点研究提供活性蛋白质材料。方法 利用高效表达质粒pET2 6b+ 克隆了大肠杆菌TyrA基因 ,并在其C端融合了一个由 6个组氨酸组成的his tag以利分离纯化。 结果 T蛋白的表达量达每 1L培养液 2 0 0mg ,细胞裂解液经一次his tag亲和柱色谱 ,纯度达 98% ,分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶的比活性分别为 130和 98U·mg-1。结论 本法表达的大肠杆菌T蛋白 ,表达量高 ,纯化容易 ,酶活性正常 ,为进一步研究T蛋白的结构与功能 ,并进行新药设计奠定了基础。

大肠杆菌T蛋白的聚合状态分析

目的解析大肠杆菌T蛋白的四级结构。方法利用分段克隆法克隆表达了T蛋白及其两个独立结构域分支酸变位酶(CM,T/1-94)和预苯酸脱氢酶(PDH,T/93-373),再利用SDS-PAGE测得变性条件下T蛋白、CM和PDH的Mr分别为42×103,11×103和32×103,HPLC测得天然条件下CM和PDH的Mr分别为25×103和63×103,再用化学交联法分析聚合状态。结果显示T蛋白、独立结构域CM和PDH均为二聚体。结论说明大肠杆菌T蛋白二聚体是通过CM与CM、PDH与PDH相连的。

大肠杆菌T蛋白的聚合状态分析

目的 解析大肠杆菌T蛋白的四级结构。方法 利用分段克隆法克隆表达了T蛋白及其两个独立结构域分支酸变位酶（CM，T/1-94）和预苯酸脱氢酶（PDH，T／93-373），再利用SDS-PAGE测得变性条件下T蛋白、CM和PDH的M。分别为42×103，11×103和32×103，HPLC测得天然条件下CM和PDH的M。分别为25×103和63×103，再用化学交联法分析聚合状态。结果 T蛋白、独立结构域CM和PDH均为二聚体。结论 说明大肠杆菌T蛋白二聚体是通过CM与CM、PDH与PDH相连的。