大肠杆菌O11 O-抗原基因簇序列的破译及特异分子标识的鉴定

大肠杆菌O11是一种可在人畜间交叉传染的强致病菌,具有潜在流行性爆发的危险。现完成了O11 O-抗原基因簇的破译,筛选和鉴定了多种特异分子标识,并实现了对大肠杆菌O11的快速、灵敏和准确的分子分型检测。利用鸟枪法测定大肠杆菌O11 O-抗原基因簇的序列全长为14180bp,生物信息学方法分析序列结构,共发现12个基因:GDP-L型岩藻糖合成途径基因(gmd,fcl,gmm,manC,manB)、UDP-N乙酰葡萄糖C4异构酶基因(gne)、O-抗原转运酶基因(wzx)、O-抗原聚合酶基因(wzy)和4个糖基转移酶基因;用PCR方法筛选出2个针对大肠杆菌O11的特异基因和4对特异引物,并进行环境样品检测实验鉴定了该PCR检测方法的灵敏度;设计并筛选出8条针对大肠杆菌O11的特异探针。

用重组大肠杆菌JM109(pKST11)转化苯生产顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯

顺 1,2 二羟基 3,5 环己二烯 (简称DHCD)是航天业、电子工业、医药业以及精细化工业上重要的手性化合物。利用重组E coliJM10 9(pKST11) ,采用适时监测发酵过程中全细胞甲苯双加氧酶 (Toluenedioxygenase,TDO)活性的方法 ,研究了发酵生产DHCD工艺中的重要影响因子IPTG以及底物苯的供给方式对DHCD产量的影响。研究结果表明 :(1)发酵初期利用IPTG诱导TDO的表达 ,不利于细胞生长 ,在对数生长中期 (6或 8h) ,采用 0 5mmol LIPTG即可诱导出TDO的最高表达。 (2 )发酵液中的苯对全细胞甲苯双加氧酶 (TDO)的活性有抑制作用 ,而利用液体石蜡作为缓释剂进行两相法发酵则降低了苯的毒害 ,明显提高了DHCD的产量。当采用传统的通气供苯方法 ,DHCD的产量仅有 7 5g L ;批式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量提高到 2 2 6g L ,是通气供苯法的 3倍 ;而采用流加的方式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量进一步提高到 36 8g L ,是通气供苯法的 5倍。证明通过发酵工艺的优化可以解决苯的毒害与苯作为反应底物在水相中需要有一定浓度之间的矛盾 ,获得较好的转化结果。

基于金属-生物分子骨架(Bio-MOF-11)材料催化性能的牛奶中大肠杆菌O157:H7快速定量检测

本研究的目的是建立一种基于金属-生物分子骨架催化性能的快速定量检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的新方法。以腺嘌呤和醋酸钴为原料,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂合成一种钴金属-生物分子骨架(Bio-MOF-11)。对Bio-MOF-11的催化性能进行研究,发现Bio-MOF-11具有和辣根过氧化物酶(HRP)类似的催化活性,并能在无过氧化氢(H2O2)存在的情况下催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色。基于此建立一种通过磁性微球进行特异性富集,通过检测与靶标结合的Bio-MOF-11的量间接检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的方法,该方法的线性范围为3×10^3-6 CFU/mL,检测限为8 CFU/mL,检测时间为25 min。该方法能快速,简单,高灵敏度、高选择性定量地检测出牛奶中的大肠杆菌O157:H7,在食源性致病菌的快速筛查中具有重要的应用价值。

抗鸡大肠杆菌F11菌毛单克隆抗体的研制

将充分菌毛化的大肠杆菌C1976_79(pap +)经 4‰甲醛灭活作为免疫原免疫BALB/c小鼠 ,经淋巴细胞杂交瘤技术 ,用间接ELISA筛选获得FA1、FB11两株抗FB11菌毛单抗 ,其ELISA效价分别为 18log2 和 15log2 试管凝集价分别为 8log2 和 6log2 。免疫印迹实验表明 :两株单抗均能与鸡大肠杆菌F11菌毛反应 ,识别分子量为 18kD左右的菌毛蛋白。同时对猪病原性大肠杆菌进行检测 ,结果均无交叉反应。这表明F11菌毛是不同于K88、K99、987P、F4 1及F18等粘附素的一种大肠杆菌菌毛。

牛β-防御素BNBD11基因在大肠杆菌中的表达

探索牛β-防御素BNBD11原核表达及纯化的技术路线。根据已报道的BNBD11的氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计合成BNBD11基因。构建重组表达载体pET32a-BNBD11,转入E.coli BL21,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。经SDS-PAGE检测融合蛋白结果显示,大部分表达产物以可溶形式存在,用Ni Sepharose柱层析纯化融合蛋白。融合蛋白经甲酸切割后,再次用Ni Sepharose柱层析去除带有His-Tag的杂蛋白,最终得到纯化的重组BNBD11。实验实现了BNBD11在大肠杆菌中的融合表达,并纯化了获得的重组BNBD11。

人白细胞介素11的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

从人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７抽提总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增到人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ，克隆于ｐＢＳ－ＳＫ，以双脱氧链终止法进行序列分析；扩增去除Ｎ 端第一个氨基酸的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ，克隆于硫氧还蛋白融合表达载体ｐＴｈｉｏＨｉｓＡ，经过对表达质粒的改造，使融合表达的ＩＬ－１１能被肠激酶精确切割；表达产物经金属鏊合亲合层析后经肠激酶切，再通过阳离子交换层析纯化后，用其依赖细胞株７ＴＤ１检测活性．结果表明，克隆的ＩＬ－１１ｃＤＮＡ 序列与文献报道一致；表达的融合蛋白占菌体总蛋白的３０％ 左右，以可溶性形式存在；纯化产物具有维持依赖细胞株生长的能力．由此，获得了较高纯度的具有生物学活性的ｒｈＩＬ－１１，为中试生产奠定了基础．

缬草-4,7(11)-二烯在大肠杆菌中的生物合成

缬草-4,7(11)-二烯是一种双环倍半萜烯类化合物,具有镇静、减缓压力、抗焦虑的作用,可用来治疗注意力缺陷多动症(ADHD)等精神疾病。旨在实现缬草-4,7(11)-二烯在大肠杆菌中的从头合成,通过在大肠杆菌BL21(DE3)过表达酵母源,甲羟戊酸途径中催化乙酰辅酶A合成焦磷酸法尼基(FPP)的8个相关基因及来源于缬草属植物(Valeriana officinalis)的缬草-4,7(11)-二烯合酶(VoTPS)基因;并采用水相和有机相双相发酵的方法,通过GC-MS在有机相中检测到了缬草-4,7(11)-二烯,实现了大肠杆菌中从头合成缬草-4,7(11)-二烯。并对IPTG浓度、蛋白诱导温度和选择不同的有机相等方面进行初步优化后,确定发酵条件为:蛋白诱导温度20℃、IPTG的浓度为0.1 mmol/L,有机相为正十二烷。

大肠杆菌^(60)Co诱变育种及其发酵生产聚唾液酸条件

对产聚唾液酸菌株大肠杆菌WX J11进行6 0 Co诱变 ,筛选出高产突变株WX J4 ,其聚唾液酸产量可达 10 0 1mg/L ,通过优化发酵条件即在 2 50mL的摇瓶中 ,2 50r/min转速下 ,37℃恒温培养 6 5h ,起始 pH值为 7.8,装液量为 4 0mL ,使聚唾液酸的产量提高到 150 0mg/L .聚唾液酸在菌体生长停止后释放到培养基中 ,动力学上表现为次级代谢产物 .此外 ,还对聚唾液酸的提取、水解和唾液酸的纯化作了初步研究 .

鸡大肠杆菌菌株F11菌毛的鉴定

从患败血症或大肠菌病病鸡分离的大肠杆菌中提纯菌毛，当这些菌株培养于固体培养基上时，能表达亚单位分子量约为１８ＫＤａ的菌毛，形态，生化，血清学，功能和分子等的特征揭示１８ＫＤａ的菌毛等同于Ｆ１１菌毛，普查结果表明：７８％的鸡大肠杆菌能表达Ｆ１１菌毛，除美国Ｆ１１菌毛表达率较高外，表达Ｆ１１菌毛菌株的流行与国别无关，鸡大肠杆菌Ｆ１１菌毛的表达与其对鸡气管和咽上皮细胞的吸附能力并无联系。

重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷D

莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)是一种稀有具有高甜度的甜菊糖苷类化合物。本文实现了重组大肠杆菌全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)合成RD。以水稻c DNA为模板,扩增得到葡萄糖基转移酶基因eugt11,构建了重组菌株E.coli BL21(p ETDuet-eugt11),并成功表达了重组蛋白6His-EUGT11。通过Ni柱亲和层析纯化并在体外酶催化反应表征了其催化活性。将重组菌BL21(p ETDuet-eugt11)应用于催化合成RD研究。探讨了反应体系pH、温度、柠檬酸钠浓度、菌体密度、二价金属离子、二甲苯体积分数、UDPG添加浓度对反应效率的影响。单因素考察结果显示,在菌体密度0.16 g湿细胞/m L反应液,底物RA浓度为1.0 mmol/L,pH 8.0,60 mmol/L柠檬酸钠,1%二甲苯,0.1 mmol/L Zn Cl2,12.0 mmol/L UDPG,反应温度42℃,反应时间24 h的条件下,RD产量为123.6 mg/L(约0.1 mmol/L)。

绵羊是O157大肠杆菌的自然贮主

最近,美国Indira T,Kudva等通过测定证实,绵羊也是O157:H7大肠杆菌的一个自然贮主。从35只6月份以后放牧的健康母羊采粪样,每只羊采10g,用选择富集法培养。结果,不仅从绵羊粪便中分离出O157:H7大肠杆菌,而且呈明显的季节性。在6月份采样时有11只羊(31％)O157:H7大肠杆菌阳性,8月份时2只(5.7％)阳性,11月份无阳性。

禽致病性大肠杆菌毒力基因F11分布的检测及其表达

为研究禽致病性大肠杆菌F11毒力基因的功能,根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力基因F11的序列,设计合成特异性引物,通过PCR方法检测了毒力基因F11在禽致病性大肠杆菌中的分布,并以IMT5155基因组DNA为模板扩增F11基因片段,将其定向克隆到pET-28a(+)载体中构建原核表达质粒pET-28a-F11,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,纯化表达产物,制备免疫血清进行黏附抑制试验。结果显示,F11基因在禽致病性大肠杆菌中的分布率为22.2%(10/45),主要分布于大肠杆菌B2进化群中。利用F11免疫血清进行的Western-blot分析表明,F11可以在实验室培养条件下正常表达。黏附抑制试验显示,F11免疫血清可以抑制禽致病性大肠杆菌IMT5155对宿主细胞的黏附,表明F11可能在禽致病性大肠杆菌感染过程中发挥作用。

肠出血性大肠杆菌O26∶H11鞭毛抗原的诱导及鉴定研究

目的对肠出血性大肠杆菌(EHEC)O26∶H11鞭毛抗原诱导及鉴定进行研究,为日常检测提供可借鉴的方法。方法对疑似EHEC O26∶H11菌株进行生化鉴定和血清分型,比较37℃及28℃2种温度Swarm琼脂诱导鞭毛抗原的效果,并采用荧光定量PCR检测8种致泻性大肠杆菌毒力基因eae、stx1、stx2、lt、st、bfp A、aggR和ipa H。结果 28℃诱导鞭毛抗原H11血清凝集为阳性,37℃诱导鞭毛抗原血清凝集为阴性;毒力基因检测结果显示stx1和eae基因阳性,其余均为阴性;菌株鉴定为EHEC O26∶H11。结论 28℃Swarm琼脂可诱导鞭毛H11,肠出血性大肠杆菌O26∶H11鉴定时应检测相关毒力基因。

pTYB11载体的应用及其重组子破菌条件的研究

IMPACTTM—CN蛋白质纯化系统的pTYB11载体的应用,有利于快速分离靶蛋白。因靶蛋白位于胞内,需采取有效破碎手段获取。采用超声波破碎,试验找出重组大肠杆菌的最佳破碎条件为:超声时间占空比为3:7,输出功率40W,破碎0.5h。western-blotting检验可以得到抗原性正常的靶蛋白。

人白细胞介素11基因在大肠杆菌中的克隆与表达

将部分缺失的人白细胞介素１１的基因片段克隆大肠杆菌高效表达载体ＰＥｘ３１Ｂ，经限制性内切酶及ＤＮＡ序列分析鉴定证实，获得了阳性重组克隆，命名为ｐＥｘ３１－ＩＬ１１。重组子转化相应的受体菌，通过温度诱导得到了表达产品，ＳＤＳ，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明，在大肠菌中ｈＩＬ－１１的表达量占菌体总蛋白的５０％左右。ｈＩＬ－１１基因片段在ＰＥｘ３１Ｂ载体中所表达的蛋白融合了ＭＳ２聚合酶Ｎ－端９９个氨基酸。

大肠杆菌来源的人乳头瘤病毒11型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

【目的】利用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒11型病毒样颗粒(HPV11VLPs),并对其免疫原性和所诱导中和抗体的型交叉反应性进行研究。【方法】在大肠杆菌ER2566中非融合表达HPV11-L1蛋白,并通过离子交换层析,疏水相互作用层析其进行纯化。纯化后的HPV11-L1经体外组装形成病毒样颗粒,通过动态光散射,透射电镜检测其形态,并通过多种HPV型别假病毒中和实验评价HPV11VLPs的免疫原性及型交叉反应性。【结果】HPV11-L1蛋白在大肠杆菌中可以以可溶形式表达。经过硫酸铵沉淀、离子交换和疏水相互作用色谱纯化,目的蛋白纯度能够达到95%以上。纯化的HPV11-L1蛋白去除还原剂DTT后,能够在体外自发组装成为直径约50nm、与天然病毒颗粒形态高度相似的VLPs。动物实验结果显示,该病毒样颗粒在小鼠体内的中和抗体半数有效剂量(ED50)为0.031μg,在小鼠体内可诱导高达106的中和抗体滴度,这些中和抗体与HPV6有较好的交叉反应,与HPV18有一定的交叉反应,而与HPV16没有明显的交叉反应,这一结果与分子进化树的分析相一致。【结论】本研究利用原核表达系统获得了具有较高免疫原性的HPV11VLPs,为HPV11预防性疫苗的研制奠定了良好的基础。

大豆PM2蛋白11氨基酸结构域的耐盐功能鉴定

大豆PM2蛋白属LEA3(late embryogenes is abundant group3)蛋白.以含大豆PM2基因的重组载体为模板,PCR法扩增出可编码6拷贝11-氨基酸重复序列的基因片段PM2D.构建pET28a/PM2D重组载体,并转化大肠杆菌得到重组菌BL21/PM2D.SDS-PAGE电泳结果表明,BL21/PM2D重组菌可被诱导表达相对分子质量约为15000的蛋白条带,与目的蛋白的理论相对分子质量(13600)接近.利用DNASIS软件分析,PM2D缺失短肽的亲水指数为1.12.将重组菌BL21/PM2和BL21/PM2D分别涂布在含500mmol/LNaCl和1200mmol/L山梨糖的固体培养基上,计算重组菌的存活率.结果显示,两种重组菌在含500mmol/LNaCl培养基上的存活率分别为30.8%和26.0%,均高于对照菌(BL21/pET28a)的存活率;在含1200mmol/L山梨糖培养基上的存活率分别为59.7%和59.3%,与对照BL21/pET28a菌株的存活率相比无明显差异.PM2D短肽长度为PM2蛋白全长的1/4,但BL21/PM2D重组菌的耐盐能力为BL21/PM2重组菌的80%左右.表明11-氨基酸重复序列区是PM2蛋白序列的一个耐盐结构域.

亚抑菌浓度氟苯尼考作用下质粒pSD11对大肠杆菌适应性的影响

通过分析cfr阳性质粒pSD11对大肠杆菌的适应性影响,并测定氟苯尼考对携带质粒pSD11的大肠杆菌MG1655(Escherichia coli MG1655)的最低筛选浓度(MSC),评价亚抑菌浓度氟苯尼考作用下多重耐药基因cfr在大肠杆菌中的持续存在和扩散传播的风险.通过电转化的方法将质粒pSD11导入模式菌E.coli MG1655中,获得耐药菌株E.coli MG1655/pSD11.通过测定生长曲线,比较无抗生素作用下耐药菌株E.coli MG1655/pSD11与同源敏感菌株E.coli MG1655的生长动力学参数,评价质粒pSD11对宿主菌适应性的影响.并通过比较分析不同亚抑菌浓度(0.031 25,0.062 5,0.125,0.25,0.5,1.0和2.0μg/mL)氟苯尼考作用下的生长速率,测定氟苯尼考对携带质粒pSD11的宿主菌最小筛选浓度(MSC).携带质粒pSD11的耐药菌E.coli MG1655/pSD11的延滞时间(2.853 3±0.031 8 h/λ)相对于同源敏感菌E.coli MG1655极显著延长(2.825 3±0.024 4 h/λ),且世代时间也显著延长(分别为:1.705 7±0.006 4 h/G和1.526 9±0.007 8 h/G).氟苯尼考对耐药菌E.coli MG1655/pSD11的MSC为0.042 5μg/mL约为相应敏感菌的MICsus的1/100.本研究表明携带cfr基因的质粒pSD11在无抗生素选择下对宿主菌有明显的适应性影响,但是在极低的氟苯尼考浓度的作用下存在选择优势,能够平衡适应性成本使宿主菌得到富集与传播,以期为对该质粒在环境中的传播风险评估及氟苯尼考的临床应用提供的参考.

亲合层析法纯化白细胞介素11

白细胞介素 1 1 (IL - 1 1 )是一种具有调节功能的蛋白质。一般采用含有IL - 1 1基因的硫氧还蛋白系统在重组大肠杆菌中来表达制备IL - 1 1融合蛋白 ,产物经金属鏊合层析进行初次分离。本文对融合蛋白IL - 1 1进行亲合纯化工艺研究 ,结果表明 ,IL - 1 1的纯度和回收率均达到较高的水平 。