小鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养方法及优化

目的探究并优化新生小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法,为星形胶质细胞的体外培养提供更优解。方法为优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,取新生3 d的C57BL/6J小鼠大脑皮质组织,去除脑膜和血管,经胰酶消化后离心,加入高糖的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)吹打形成细胞悬液。进一步通过差速贴壁法、十字交叉手摇法以及恒温振摇法进行纯化,将细胞分别以不同培养密度接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中,并通过形态学观察,免疫荧光染色等方法对星形胶质细胞进行纯度鉴定。结果新生小鼠大脑皮质细胞以5×10^(6)个/瓶密度接种效果好,活性高;纯化过程中使用高糖DMEM培养基联合差速贴壁法、十字交叉手摇法及恒温振摇法,星形胶质细胞纯度可达99%。结论成功建立并优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞的原代培养方法。

IL-1β或IL-6对大脑皮质星形胶质细胞细胞周期的影响

为研究白细胞介素1β(Interleukin1β,IL1β)和白细胞介素6(Interleukin6,IL6)对培养新生大鼠的大脑皮质星形胶质细胞增殖的影响,本研究采用体外细胞培养方法获得新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞,然后在培养液中分别加入IL1β和IL6,在作用6、12及24h后,通过流式细胞仪检测IL1β、IL6对星形胶质细胞细胞周期的影响。结果显示IL1β、IL6作用于星形胶质细胞后,可引起细胞周期的显著变化,表现为G1期细胞数减少,S期、G2/M期细胞数增多,以作用12h时变化最明显。提示IL1β、IL6可促进体外培养的星形胶质细胞增殖。

吸氧预处理对大鼠大脑皮质星形胶质细胞的影响

目的观察吸氧预处理对大鼠大脑皮质内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响,探讨吸氧预处理产生的脑缺血耐受与星形胶质细胞的关系。方法雄性SD大鼠6只,随机分为两组:吸氧预处理组和对照组各3只。吸氧预处理组大鼠吸入1000ml/L氧气,持续24h。间隔24h后经心脏多聚甲醛灌注,取脑,固定,冷冻切片机冠状切片;对照组大鼠不给予吸氧预处理,吸空气24h,余同吸氧预处理组。用免疫组化法(ABC法)进行免疫组化染色,观察胶质原纤维酸性蛋白在大鼠大脑皮质的表达,比较两组大鼠的表达差异。结果吸氧预处理组大鼠各部大脑皮质内胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞明显增多(P<0.05),包括枕皮质(t=8.32)、压后部皮质(t=6.17)、顶皮质(t=4.76)、额皮质(t=4.93)、皮质前(t=6.17)和后肢区(t=7.48)等,细胞分布密集。胶质细胞形态亦与对照组不同:胞体肥大,突起粗而长,染色深。对照组大鼠大脑皮质内GFAP阳性细胞呈散在分布,阳性细胞的胞体小,突起细而短,染色浅淡。结论吸氧预处理可以明显刺激大鼠大脑皮质GFAP的产生,使星形胶质细胞处于激活状态,与诱导脑缺血耐受的产生有关。

地塞米松诱导培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞凋亡

目的 研究地塞米松诱导纯化培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞凋亡的作用。方法 不同浓度的地塞米松(浓度为 10 -3 、 10 -4、 10 -5mol/L)与纯化培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞共同孵育 18小时后 ,吖啶橙染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态学改变 ,流式细胞仪检测细胞凋亡和结晶紫比色法酶标仪测定活细胞数。结果 (1)吖啶橙染色荧光显微镜观察 :10 -4组偶见细胞凋亡 ,10 -3 组可见许多细胞有典型的凋亡形态学改变核固缩 ,深染 ,或肿胀 ,碎裂 ,并可见凋亡小体。 (2 )流式细胞仪检测细胞凋亡 :10 -3 组细胞凋亡率为 15 99% ,与其它三组相比明显增高 ,有显著性差异 (P <0 0 1)。 (3)结晶紫法酶标仪测定活细胞数 :10 -3 组OD值为 0 . 185与其它三组相比明显下降 ,有显著性差异 (P <0 0 1) ,表明活细胞数明显减少。结论 大剂量地塞米松可诱导体外的星形胶质细胞凋亡。

大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及其促神经突起生长作用研究

取生后１周以内ＳＤ大鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化结合机械吹打使细胞分散，制成较大量的初细胞悬液。将初细胞悬液先行粘附处理３０ｍｉｎ以排除其中的成纤维细胞，再制成较小量的次细胞悬液。将之接种到预先涂有鼠尾胶原的培养瓶中，令其贴壁３～５ｈ，细胞密度约１×１０５个／ｃｍ２。补加培养液，继续培养。培养液为含２０％小牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２混合培养液。俟细胞铺满瓶底后传代。届时细胞悬液亦行３０ｍｉｎ的粘附处理。以０．５×１０５个／ｃｍ２的细胞密度种植于培养瓶中。传代后先培养４８ｈ；换成无血清培养液再培养４８ｈ并收集条件培养液。对部分传代细胞进行胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学杂色鉴定，证明传代后的细胞中星形胶质细胞比例达９４．７１％。取条件培养液及单纯ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液各１份，分别与２份有血清培养液混合，制成实验组与对照组两种培养液，以悬滴法培养鸡胚背根节。４８ｈ后，比较两组背根节神经突起的平均长度。经统计学分析揭示，实验组背根节神经突起平均长度显著大于对照组者，说明星形胶质细胞具有明显的促神经突起生长作用。

大脑皮质星形胶质细胞的培养和鉴定

为建立有效的星形胶质细胞体外培养体系,并为体外研究星形胶质细胞的功能奠定基础,本试验于无菌条件下取新生1 d^3 d的SD大鼠的大脑皮质,经1.25 g/L胰酶消化及机械吹打分离细胞,差速贴壁处理以去除成纤维细胞,用含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液培养。之后借助摇床振荡及传代的方法去除其他细胞,并以GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果表明,分离培养的细胞具备典型的星形胶质细胞形态,并表达星形胶质细胞特异性抗原GFAP,纯化率达95%以上。试验表明上述方法可获得符合体外研究要求的星形胶质细胞。

大鼠大脑皮质星形胶质细胞条件培养液促进小脑皮质神经元的生长

本研究从大鼠大脑皮质分离、纯化星形胶质细胞,再经培养后收集星形胶质细胞的无血清条件培养液。用盖玻片培养法与快速自动比色微量分析法研究了星形胶质细胞条件培养液对小脑皮质神经元生存以及神经元活力的影响。发现星形胶质细胞条件培养液能够明显提高小脑皮质神经元的体外存活率,增强神经元的活力。表明星形胶质细胞具有神经营养性作用。

细胞外调节蛋白激酶在体外培养下大鼠大脑皮质星形胶质细胞的表达

目的：研究大鼠大脑皮质星形胶质细胞细胞外调节蛋白激酶（ERK）表达。方法：用生后2～3dSD大鼠，在无菌条件下取大脑皮质，制备细胞悬液，以GFAP鉴定星形胶质细胞；用免疫细胞化学方法研究星形胶质细胞ERK1表达。结果：星形胶质细胞的纯度达95％以上，ERK1免疫阳性物质呈棕黄色，分布于星形胶质细胞胞体与突起中。结论：培养的大鼠星形胶质细胞表达ERK1，其可能与星形胶质细胞信号转导有关。

低强度聚焦超声对新生小鼠大脑皮层发育及星形胶质细胞活化的影响

目的 观察低强度聚焦超声(LIFU)对新生小鼠大脑皮层发育及星形胶质细胞活化的影响。方法 将80只新生小鼠分为LIFU组(n=48)和假手术组(n=32)。对LIFU组小鼠以LIFU连续波辐照3天、每天5 min;将假手术组小鼠置入声场中,不施加声波。采用蛋白质印迹法检测皮层NFIX蛋白表达,以免疫荧光染色观察c-Fos、NFIX及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,以EdU染色观察皮层细胞增殖情况。结果 LIFU辐照后1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h, LIFU组小鼠大脑皮层c-Fos表达数量均较假手术组显著增加(P均<0.05),于1.5 h达峰,之后逐渐递减。辐照后1 h, LIFU组小鼠皮层NFIX蛋白表达量明显高于假手术组;辐照后1、2、3 h及1个月,LIFU组小鼠皮层NFIX数量均较假手术组明显增加(P均<0.05)。辐照后1个月,LIFU组小鼠大脑皮层GFAP阳性细胞数量明显增加,且细胞呈星形,从胞体发出大量长突起。辐照后16、24 h, LIFU组EdU阳性细胞数量较假手术组显著增多(P均<0.05),且增殖的EdU阳性细胞存在NFIX阳性细胞共表达。结论 LIFU可激活新生小鼠大脑皮层c-Fos表达,促进皮层中细胞增殖和GFAP星形胶质细胞增加,可能与NFIX有关。

酸枣仁汤对抑郁大鼠大脑皮质星形胶质细胞和缝隙连接蛋白43的影响

目的观察酸枣仁汤(SZRD)对抑郁大鼠大脑皮质星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和缝隙连接蛋白43(Cx43)的作用。方法采用慢性不可预见性温和应激(CUMS)结合孤养建立大鼠抑郁模型。大鼠随机分为空白对照组、模型组、氟西汀组和SZRD 15g·kg^(-1)组、SZRD 3.75g·kg^(-1)组,各组给予相应药物灌胃,观察大鼠糖水消耗、旷场实验指标的变化;HE染色检测大脑皮质神经组织细胞损伤情况;免疫组化染色法检测大脑皮质GFAP和Cx43的表达。结果与空白对照组相比,模型组大鼠糖水消耗量明显减少(P<0.05),水平和垂直活动明显减少(P<0.05),神经损伤总评分明显增加(P<0.05);模型组大鼠大脑皮质星形胶质细胞GFAP和Cx43表达增强(P<0.05),SZRD干预后GFAP和Cx43表达较模型组明显减弱(P<0.05),SZRD 15g·kg^(-1)组作用与氟西汀组无显著性差异。结论 SZRD能增加CUMS抑郁大鼠糖水消耗量和自主活动,减轻CUMS抑郁大鼠神经细胞损伤,降低CUMS抑郁大鼠大脑皮质星形胶质细胞GFAP和Cx43的表达。

雷公藤内酯醇对大鼠大脑皮质内注射β-淀粉样蛋白后星形胶质细胞及胆碱能纤维的影响

目的：探讨雷公藤内酯醇（TP）对大鼠大脑皮质内注射β-淀粉样蛋白（AB）后星形胶质细胞及胆碱能纤维的影响。方法：采用GFAP免疫组织化学方法、AChE组织化学方法检测各组大鼠大脑皮质星形胶质细胞和胆碱能纤维的表达。结果：Aβ组大鼠大脑皮质GFAP阳性星形胶质细胞数量、平均面积和平均光密度明显高于对照组，用药组大鼠大脑皮质GFAP阳性星形胶质细胞数量、平均面积和平均光密度较Aβ组明显减少；Aβ组大鼠大脑皮质胆碱能纤维密度明显低于对照组，用药组大鼠大脑皮质胆碱能纤维密度较Aβ组明显升高。结论：TP能抑制Aβ诱导的星形胶质细胞的活化，减轻Aβ所致的胆碱能纤维损害。

紫云英苷诱导炎性痛小鼠前扣带回皮质星形胶质细胞自噬

目的:探讨紫云英苷(astragalin,AST)对完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)诱发的炎性痛模型小鼠前扣带回皮质内星形胶质细胞活化状态及自噬相关蛋白表达水平的影响。方法:选取24只6月龄雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:对照(control)组、生理盐水(saline)组和CFA模型组、CFA+60 mg/kg AST给药组,每组各6只动物。AST给药组小鼠按体重进行腹腔注射给予60 mg/kg AST,连续给药21 d。采用von Frey纤维丝测定各组小鼠机械缩足反应阈值;利用多重免疫荧光染色法检测各组小鼠前扣带回皮质自噬相关因子LC3、p62、ATG12和beclin-1的表达以及星形胶质细胞活化情况;Western blot法检测各组小鼠前扣带回皮质内自噬相关蛋白LC3、p62、ATG12和beclin-1的表达水平。结果:行为学测试结果显示,AST显著提高CFA小鼠的机械疼痛阈值(P<0.05)。免疫荧光染色结果表明,AST显著增强CFA小鼠前扣带回皮质LC3(P<0.01)、ATG12(P<0.01)、beclin-1(P<0.05)的荧光强度,减弱p62(P<0.05)的荧光强度,并抑制星形胶质细胞活化。Western blot结果进一步表明,AST显著上调CFA小鼠前扣带回皮质内LC3(P<0.01)、ATG12(P<0.01)和beclin-1(P<0.01)的表达水平,下调p62(P<0.05)表达水平。结论:AST可缓解CFA小鼠的炎症性疼痛,其镇痛机制可能与抑制CFA小鼠前扣带回皮质星形胶质细胞活化,并促进其发生自噬有关。

不同年龄大鼠大脑皮质损伤后的星形胶质细胞反应

对幼年（３月龄）、成年（１２月龄）与老年（２７月龄）三组雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠的躯感皮质进行针刺后，在１～２１ｄ时间内用光镜与电镜观察损伤后的星形胶质细胞反应，探讨年龄因素对星形胶质细胞反应的影响。结果表明：反应性星形细胞在水肿、细胞分裂、吞噬、肥大与胶质界膜形成等方面均表现出程度上和发生时间上的年龄差异。幼年大鼠的星形细胞不仅水肿更为显著且出现更早，并且表现出向变性与最后死亡以及向代偿性合成增强两个方向发展、三组动物的星形细胞分裂活动以术后３ｄ最明显，尤以幼年组更多见，并出现活跃的吞噬现象．

SD乳鼠原代皮质神经元及星形胶质细胞同时培养的实验方法

背景:目前获取原代皮质神经元和星形胶质细胞的方法很多,传统方法通常是分别获取这两种细胞,但实验方法过于繁琐且浪费实验材料。找到一种简单、经济、可行并同时提取这两种细胞的培养方法尤为重要。目的:观察同时提取培养SD乳鼠大脑皮质神经元及星形胶质细胞的效果及注意事项。方法:选用出生24 h内的SD乳鼠,用体积分数为75%乙醇浸泡消毒,待乳鼠昏迷后断脊处死,沿乳鼠颈部用剪刀离断头颅并放入装有高糖DMEM的小烧杯中,沿矢状缝打开头颅并取出大脑放入盛有高糖DMEM的培养皿中。在冰上剥出脑膜及血管,夹取皮质表面2.0-3.0 mm的脑组织,通过木瓜酶和DNA酶进行消化20 min,用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化。以细胞浓度为1.0×10^(9) L^(-1)种植于含有爬片(用多聚赖氨酸处理)的6孔板中,分别于1,3,5,7 d通过倒置荧光显微镜下观察神经元的形态变化,使用Calcien-AM进行活细胞染色观察细胞活性,β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色对神经元进行鉴定。将剩余大脑皮质进行星形胶质细胞的提取,经过胰酶消化、过滤、吹打,以适宜的浓度接种于培养瓶中,待细胞融合度达到90%时,进行恒温水平摇床振荡24 h以纯化星形胶质细胞。当细胞传代纯化后以1.0×10^(9) L^(-1)接种于6孔板中培养,GFAP免疫荧光染色对星形胶质细胞进行鉴定。结果与结论:①培养1 d后可见神经元贴壁生长,胞体增大,部分聚集生长,细胞间有少量的突触连接;培养3,5 d后胞体进一步增大,突触增粗伸长相互连接;培养7 d后神经元明显聚集,突触增长增粗,相互连接形成致密的细胞网。Calcien-AM活细胞染色可见神经元活性较好,经β-Tubulin、MAP2免疫荧光鉴定细胞纯度大于90%。②培养3 d后星形胶质细胞胞体增大,呈现梭状、不规则状,细胞间出现少量相互连接,细胞间存在较多小胶质细胞;培养5 d后胞体、突起进一步增大;培养7 d发现细胞间的小胶质细胞及其他杂质明显减少,背景较为干净。经GFAP免疫荧光鉴定细胞纯度大于95%。③此方法获得的皮质神经元和星形胶质细胞形态好、杂质少、纯度高,可满足神经科学研究对高纯度的皮质神经元及星形胶质细胞的需求。

PrP106-126对大脑皮质神经元和星形胶质细胞朊蛋白基因表达的影响

采用实时荧光定量RT-PCR的方法,对PrP106-126处理的大脑皮质神经元和星形胶质细胞模型进行了朊蛋白基因表达相对定量的研究。大脑皮质神经元经PrP106-126处理后,与SCR处理组和对照组相比,基因表达量明显下降。PrP106-126处理的星形胶质细胞与对照组和SCR处理组相比,朊蛋白基因的表达量显著升高。该试验结果为深入了解TSEs的分子致病机制和正常朊蛋白的功能提供了基础数据。

孤啡肽对大鼠大脑皮质神经元及星形胶质细胞神经甾体水平的影响

目的研究孤啡肽(orphaninFQ,OFQ)对原代培养的大鼠大脑皮质神经元及星形胶质细胞神经甾体水平的影响。方法固相萃取结合高效液相色谱-质谱联用方法测定细胞培养上清液中神经甾体的水平。结果在神经元与氯化钠溶液对照组相比,OFQ(10μmol·L-1)使硫酸脱氢表雄酮(DS)和硫酸孕烯醇酮(PS)的水平显著降低,使脱氢表雄酮(DHEA)和别孕烯醇酮(AP)的水平显著增加。在星形胶质细胞,与氯化钠溶液对照组相比,OFQ使DS和孕烯醇酮(PREG)的水平显著降低,使DHEA水平显著增加。结论OFQ不同程度影响了皮质神经元和星形胶质细胞神经甾体的合成释放。

小鼠大脑皮质星形胶质细胞原代培养与鉴定

为探讨简便、高效的大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,本研究取新生24 h内的ICR小鼠大脑皮层,采用物理方法将其分成约1 mm^3,震荡过滤后进行培养。通过拍照的方式记录原代培养1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和原代培养14 d后再传代培养14 d(记为P2-14 d)细胞形态;通过实时定量PCR和Western blotting比较原代培养1周、2周、3周、4周、5周和原代培养2周后再传代培养2周(即P2-2)的星形胶质细胞内胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因和蛋白水平变化。选取GFAP、S100-β和谷氨酸转运蛋白(excitatory amino acid transporter 1,EAAT1)标记星形胶质细胞,微管相关蛋白(microtubuleassociated protein 2,MAP-2)、离子钙接头蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba-1)和髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)抗体分别标记神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。通过免疫荧光染色鉴定细胞种类及纯度。研究结果显示细胞生长良好,原代培养4周星形胶质细胞内GFAP比2周、3周、5周和传代培养2周的细胞更加稳定。经免疫荧光鉴定,星形胶质细胞纯度在95%以上。本实验采用相对较简单经济的方法培养出高纯度且生理状态相对较稳定的原代星形胶质细胞,该细胞模型不仅可以用于星形胶质细胞生理功能研究,还可以用于中枢神经系统相关疾病的体外研究。

大鼠脑皮质星形胶质细胞的体外优化培养及鉴定

目的旨在获得高纯度的星形胶质细胞,并对不同培养时期的细胞进行鉴定,为进一步研究奠定基础。方法常规分离新生SD大鼠大脑皮质并制备单细胞悬液,采用差速黏附加摇床震荡法对所获得的细胞进行纯化。倒置相差显微镜及HE染色观察细胞形态,GFAP免疫荧光对获得细胞进行鉴定。结果原代培养的皮质细胞从3d开始迅速增殖,9-12d即可铺满瓶底,此时细胞呈明显的分层生长,星形胶质细胞位于底层,形态多样,阳性率为（67.2±7.1）%;经过1次传代后,GFAP阳性率有所提升（84.0±6.0）%,但不能完全去除小胶质细胞及少突胶质细胞,细胞仍呈分层生长;至第3次传代后,获得大量几乎为单一种类的星形胶质细胞,其胞体较大、突起较短粗,一般2-3个,胞核圆形或椭圆形,常偏于一侧,GFAP染色呈强阳性,阳性率可达（97.6±2.4）%。结论通过差速黏附与摇床震荡相结合的方法,获得了高纯度且生长状态良好的星形胶质细胞。