大花金挖耳内生菌的分离及抑菌活性筛选

从菊科植物大花金挖耳(Carpesium macrocephalum)的花、茎、叶、果实和根中分离出92株内生菌,其中真菌68株,细菌16株,放线菌8株;对峙法生物活性测定结果表明,其中22株内生菌分别对小麦赤霉病菌、黄瓜灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、玉米大斑病菌和苹果炭疽病菌均有较好的拮抗作用;采用生长速率法测定22株内生菌发酵产物的抑菌活性,结果表明,内生细菌H-32的发酵液稀释10倍和内生真菌H-18、Y-12、G-4、G-6的菌丝丙酮提取物在0.5 mg·mL-1(菌丝干重)的剂量下,均对番茄灰霉病菌和玉米大斑病菌菌丝生长具75%以上的抑制效果;活体组织法测定结果,H-32的发酵液和H-18、J-1、Y-17、G-6的菌丝丙酮提取物在2.0 mg·mL-1(菌丝干重)的剂量下,对番茄灰霉病的防治效果均在50%以上.综合分析认为,H-32、H-18和G-6等内生菌的抑菌作用值得进一步研究.

大花金挖耳杀菌活性的进一步研究

大花金挖耳(CarpesiummacrocephalumFranch.etSav)是菊科中杀菌活性较强的一种植物。研究进行了该植物全株及其根、茎、叶和花等5个部位6种溶剂的18种提取物对5种真菌的室内毒力测定。结果表明,大花金挖耳的活性成分主要集中在花中;大花金挖耳花的丙酮提取物对供试的小麦赤霉、苹果炭疽、玉米大斑、番茄灰霉和辣椒疫霉等5种病原菌菌丝生长的EC50分别为3280.34,3932.28,100.97,5259.20和1278.49μg/mL;在系统提取中发现,大花金挖耳花的活性成分主要分布在乙酸乙酯和乙醇相中;温度对大花金挖耳活性成分的提取影响不大。大花金挖耳全株的丙酮提取物对黄瓜霜霉菌的保护作用和治疗作用均在50%以上。上述结果表明,大花金挖耳全株,尤其是花中含有高活性的抑菌成分。

大花金挖耳花蕾中精油的化学组成及其杀菌活性研究

采用GC-MS联用技术检测了阴干的大花金挖耳花蕾中精油的化学组成及相对含量,并测定了该精油对14种常见作物病原菌的抗菌活性.结果表明,大花金挖耳花蕾精油得率为2.9%,从中鉴定出53种成分,占色谱峰总面积的86.01%,主要化学成分为(E,E)-3,7,11,15-四甲基-1,6,10,14-十六烷四烯(15.33%)、甲苯(11.32%)、(3α,5α)-3,5,14,19-四羟基强心甾-20(22)-烯(6.00%)、2-乙氧基四氢呋喃(5.44%)、亚油酸(3.51%)等.杀菌实验结果表明,该精油对小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)和小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)抑制作用最强,在0.5 mg/mL浓度下,5 d后对这2种病菌菌丝生长的抑制率均大于97%;对小麦赤霉病菌(Fusarium gra-minearum)和番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)等也有较强的抑制效果.大花金挖耳花蕾精油的化学组成及其杀菌活性研究均为首次报道.

大花金挖耳细胞悬浮系的建立及黄酮类化合物的产生

研究不同培养基、蔗糖质量浓度、pH值、接种量、NAA、6-BA、VB1及培养时间对大花金挖耳细胞生长和黄酮类化合物合成的影响。结果表明:NT液体培养基在pH5.5、蔗糖质量浓度40g/L、接种量40g/L鲜质量细胞、NAA1.0mg/L+6-BA0.2mg/L时有利于细胞的生长和黄酮类化合物合成,向NT培养基中添加1.0～4.0mg/LVB1有抑制细胞褐化的作用,大花金挖耳悬浮细胞的生长及黄酮类化合物合成随培养时间的延长,表现出先升高后降低的趋势,在接种15～21d后,细胞生物量可达23.54～24.51g/L,黄酮类化合物得率为1.19%～1.23%。

大花金挖耳细胞悬浮培养及其胞内代谢产物化感潜力的研究

为了优化大花金挖耳（Carpesium macrocephalum Franch.et Sav.）细胞悬浮培养的条件,评价其胞内代谢产物的化感潜力。本文研究了无机盐浓度不同的MS,1/2MS,B5,1/2B5,NT和1/2NT等6种培养基及NT中N,P,Ca,Mg,K等5种大量元素含量对大花金挖耳悬浮培养细胞生物合成黄酮的影响,并采用微量活性测定法测定了其细胞培养物的化感潜力。结果表明：大花金挖耳细胞悬浮培养的最优基本培养基是NT,NT中总氮浓度为50.62 mmol·L^-1,NH4^＋∶NO3^-为2∶3时,黄酮含量最高为1.38%,H2PO4^-,Ca^2＋,Mg^2＋,K^＋等离子依次在5.00,1.50,0.50-1.00,14.39-27.81 mmol·L^-1范围内有利于大花金挖耳悬浮培养细胞的生长和黄酮合成;大花金挖耳悬浮培养细胞的粗提物对供试的紫花苜蓿（Medicago sativaL.）、刺儿菜（Cephalanoplos segetum（Bge.）Kitam.）、反枝苋（Amaranthus retroflexus L.）、小白酒草（Conyza canadensis（L.）Cronq.）和小麦（Triticum aestivumL.）等5种植物幼苗根生长均具有抑制作用,毒力依次为10.66,12.32,15.85,102.16,210.96 mg·mL^-1。

不同培养条件对大花金挖耳愈伤组织生长及黄酮产量的影响

以大花金挖耳愈伤组织为材料，通过测定愈伤组织生长量、黄酮含量和产量等指标，研究了不同培养条件对大花金挖耳愈伤组织生长及其黄酮产量的影响，为大规模细胞培养生产大花金挖耳药用成分黄酮奠定基础。结果表明：不同外植体愈伤组织的黄酮含量为根〉子叶〉下胚轴，黄酮产量以根愈伤组织为最高；继代次数在3～12代愈伤组织的黄酮产量较为稳定；愈伤组织生长及黄酮生物合成的适宜培养温度为25℃；10min紫外线照射引起黄酮含量的提高；MS、B5、NT及其组合培养基中，大花金挖耳愈伤组织生长及黄酮产量随培养时间的延长，均表现出先升高后降低的趋势，在接种35．40d后愈伤组织黄酮产量达到最高值。其中NT培养基中黄酮产量高于其他培养基中愈伤组织黄酮产量。

大花金挖耳愈伤组织诱导与增殖

以大花金挖耳无菌苗的子叶、下胚轴和根为外植体,进行愈伤组织诱导与增殖研究.结果表明：大花金挖耳无菌苗的根是诱导愈伤组织的理想外植体;其愈伤组织诱导的最适培养基为：Bs＋3.0 mg/L NAA＋0.2 mg/L 6-BA,诱导率可达100%;愈伤组织的增殖在45 g/L的蔗糖、pH 5.7、光照12 h/d培养条件下可延迟愈伤组织褐化出现的时间,并维持其良好的组织结构,愈伤组织的最适继代周期为30～40 d.

大花金挖耳不同部位挥发油化学成分比较分析

采用GC-MS技术,对利用水蒸气蒸馏法从大花金挖耳根、茎、叶、花及花托等5个部位获得的挥发油组分进行了分析.从大花金挖耳5种挥发油中共鉴定出99种成分,从根、茎、叶、花及花托分别鉴定出了37、34、47、29和40种化合物,已鉴定的组分分别占相应挥发油的85.86%、84.98%、83.06%、84.58%和89.06%.5个部位挥发油化学组成差异较大,根挥发油主要成分为倍半萜类和酯类;茎挥发油主要为倍半萜和烯类(包括烯醇、烯酸、烯酮);叶和花挥发油主要为烯类(包括烯醇、烯酸、烯酮)和酯类;花托挥发油主要为倍半萜类和二萜类.

大花金挖耳细胞培养物中总黄酮含量的检测

[目的]研究大花金挖耳果实和细胞培养物总黄酮含量的定性和定量测定。[方法]采用试管法和紫外分光光度法对大花金挖耳果实和细胞培养物中的黄酮进行定性鉴定;用紫外分光光度法测定总黄酮含量。[结果]试管法和紫外分光光度法检测到大花金挖耳果实细胞培养物含有黄酮;紫外分光光度法测定时,在其最大吸收峰510 nm处测得对照品在8.00～48.00μg/ml范围内线形关系良好(r=0.999 7),平均回收率为98.60%,RSD=1.12(%n=5)。[结论]所用方法简便、准确、稳定、灵敏、重现性好,可用于大花金挖耳果实和细胞培养物总黄酮含量的检测。

大花金挖耳内生真菌H-18菌株的鉴定及其抑菌活性研究

对大花金挖耳内生真菌H-18菌株的菌丝提取物进行了抑菌活性研究并对菌株进行了鉴定.离体试验结果表明,H-18菌株菌丝体丙酮提取物在500mg/L浓度下对玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的菌丝生长抑制率均大于80%;组织法和盆栽试验结果表明,H-18菌株菌丝体丙酮提取物在2000mg/L浓度下对番茄灰霉病和辣椒疫霉病的保护效果和治疗效果均在50%以上.结合形态分类学和ITS-5.8S rDNA序列分析结果鉴定菌株H-18为同色镰孢菌(Fusarium concolor).

大花金挖耳茎叶甲醇提取物杀菌活性初步研究

采用生长速率法、孢子萌发法和果实针刺法对大花金挖耳茎叶甲醇提取物的4种溶剂萃取物杀菌活性进行较为系统地测试,并用试管法和圆形滤纸层析法对其化学成分进行预试。结果表明,4种溶剂萃取物对供试病原真菌孢子萌发及菌丝生长均具一定抑制作用,其中氯仿萃取物活性最高,在1000 mg/L剂量下对番茄灰霉病菌孢子萌发和菌丝生长抑制率分别为88.6%和90.1%;果实针刺法测试结果表明,大花金挖耳茎叶甲醇粗提物的4种溶剂萃取物对番茄灰霉病均有一定的保护作用和治疗作用,但治疗效果低于保护效果,在2000 mg/L剂量下,氯仿萃取物对番茄灰霉病菌保护防效为78.9%,和对照药剂扑海因1000 mg/L剂量处理防效(82.8%)相当;氯仿萃取物对番茄灰霉病菌治疗作用最高,防效为45.1%,但低于对照药剂扑海因的防效(54.2%),其他3种萃取物对其治疗作用均不高。化学成分预试结果表明,大花金挖耳茎叶含有香豆素、酚性成分、甾体、萜类、黄酮及其苷类、多糖及苷类、氨基酸、多肽和蛋白质以及挥发油、油脂类等。

2,4-D和KT对大花金挖耳愈伤组织诱导的影响

以大花金挖耳无菌苗的根为外植体，研究了不同质量浓度的2，4-D和KT对愈伤组织诱导的影响。结果表明：低浓度的2，4-D（0．25～0．5mg／L）单独使用促进愈伤组织形成，随着2，4-D质量浓度的增加，愈伤组织的形成逐渐变弱；在培养基、2，4-D和KT诱导愈伤组织的正交试验中，发现2，4-D对愈伤组织诱导率的影响最大，基本培养基次之，KT影响最小，对愈伤组织诱导的较优组合为B2＋2，4-D0．1mg／L＋KT0．4mg／L；在优化诱导愈伤组织的激素浓度配比试验中发现B5＋2，4-D0．1mg／L＋KT0．2～0．4mg／L对大花金挖耳愈伤组织的诱导率为100％，且产生的愈伤组织多为淡黄色、质地疏松、生长快、褐化时间长，适合于大花金挖耳愈伤组织的诱导。

大花金挖耳无菌外植体的获得及愈伤组织诱导的初步研究

以大花金挖耳（Carpesium macrocephalum Franch.et Sav）种子为材料，进行了种子消毒和愈伤组织诱导及继代的初步研究。结果表明，对大花金挖耳种子进行消毒的最佳条件为，以体积分数70％的乙醇消毒5min后，再用50％的NaClO3处理30min。在大花金挖耳无菌苗的根形成愈伤组织的正交试验中，基本培养基对愈伤组织诱导率的影响最大，NAA次之，6-BA影响最小，对愈伤组织诱导的较优组合是B5＋NAA3．0mg／L＋6-BA0．2mg／L，诱导率为100％；在优化诱导愈伤组织的激素浓度配比试验中，B5＋NAA2．0～3．0mg／L＋6-BA0．2～0．4mg／L对大花金挖耳愈伤组织的诱导率为100％，且产生的愈伤组织多为淡黄色、质地疏松、生长势极好、褐化时间长，适合于大花金挖耳愈伤组织的诱导。在培养基中分别添加500mg／LVc、和10000mg／L PVP能抑制大花金挖耳愈伤组织的褐变，且有利于愈伤组织的继代。

大花金挖耳细胞培养物中内酯的检测(简报)

以大花金挖耳果实、幼苗和细胞培养物为材料，采用特异性呈色反应法对其内酯进行定性鉴定，紫外分光光度法测定内酯含量。结果表明，大花金挖耳果实、幼苗和细胞培养物含有内酯，天名精内酯酮和供试品在219nm处有最大吸收峰，紫外分光光度法测定内酯含量在0～124．00μg／mL内服从比耳定律（R=0．9918），平均回收率为98．98％，相对标准偏差为1．92％（n=5）。说明所用方法简便、准确、稳定，适用于大花金挖耳果实、幼苗和细胞培养物内酯的检测。

微量元素对大花金挖耳悬浮细胞生长与黄酮含量的影响及其化感作用

【目的】筛选微量元素对大花金挖耳细胞培养胞内活性物质的浓度条件,为大花金挖耳大规模细胞培养活性物质开发利用提供依据。【方法】以大花金挖耳悬浮培养细胞为材料,研究Zn^(2+)、Mn^(2+)、Co^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)、I^-、BO■、MoO■等8种微量元素对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮类化合物累积的影响;并采用微量活性测定法测定细胞培养物的化感潜力。继代培养基为NT+1.0 mg·L^(-1) NAA+0.2 mg·L^(-1) BA。【结果】随培养基中Zn^(2+)、Co^(2+)、MoO■、Cu^(2+)、BO■等各处理微量元素浓度增加,大花金挖耳悬浮培养细胞生长量和黄酮含量呈先增后降趋势。MoO■、Zn^(2+)浓度为3.0μmol·L^(-1)、0.06 mmol·L^(-1)时,黄酮含量分别高达1.53%、1.46%,是对照的1.25、1.20倍;Cu^(2+)、BO■、Co^(2+)浓度分别为0.4μmol·L^(-1)、0.4 mmol·L^(-1)、0.2μmol·L^(-1)时,黄酮含量均高达1.35%,是对照的1.11倍;Mn^(2+)浓度0.1～0.8 mmol·L^(-1)时,黄酮含量逐渐降低,从1.22%下降到0.43%;I^-浓度在5～20μmol·L^(-1)范围内时,黄酮含量变化不大;0.1 mmol·L^(-1) Fe^(2+)浓度最适于细胞生长和黄酮合成;试验中,添加Zn^(2+)、Mn^(2+)、Co^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)、I^-、BO■、MoO■等8种微量元素可分别使细胞总黄酮产量达到382.00、291.28、327.34、337.82、288.89、293.90、333.76、379.00 mg·L^(-1),微量元素提高细胞总黄酮产量大小顺序依次是:Zn^(2+)>MoO■>Cu^(2+)>BO■>Co^(2+)>I^->Mn^(2+)>Fe^(2+)。大花金挖耳悬浮培养细胞的粗提物对供试的苘麻Abutilon theophrasti、鬼针草Bidens pilosa、黄瓜Cucumis sativus和黄豆Glycine max等4种植物幼苗根生长均具有抑制作用,毒力依次为19.86、14.69、19.03、59.07 mg·L^(-1)。【结论】在培养基中适量添加微量元素有利于大花金挖耳细胞的生长和黄酮的生物合成,但过高浓度的微量元素会导致黄酮生物合成能力下降;大花金挖耳悬浮细胞的胞内代谢产物对4种受体植物具有不同程度的化感作用。

大花金挖耳提取物的血小板聚集作用

本文报道了大花金挖耳 3种提取物对血小板聚集的影响 ,证明本品花水提取物的抑制血小板聚集作用最强 ,其次为茎叶水提取物 >醇提取物。

培养基主成分优化提高大花金挖耳胞内黄酮产量

【目的】优化组合培养基中大量、微量元素及附加激素等培养条件,筛选出大花金挖耳细胞培养黄酮的生产培养基。【方法】以NT+1.0mg·L^-1NAA+0.2mg·L^-16-BA为基本培养基,先优化组合其大量元素NH4^+、NO3^-、K^+,再优化组合微量元素MoO4^2-、Zn^2+、BO3^3-、Co^2+、Cu^2+、I^-、Mn^2+,最后分别附加2,4-D、KT、GA3,测定大花金挖耳悬浮培养细胞生长、黄酮含量及产量。【结果】大量元素优化、微量元素优化及附加激素KT、GA3,大花金挖耳细胞培养物中黄酮产量均得到了显著提升(P<0.05),添加2,4-D降低了黄酮产量。本研究筛选得到大花金挖耳细胞培养生产黄酮类化合物的最佳NT培养基为:大量元素NH4^+、NO3^-、K^+分别为15.46mmol·L^-1、14.10mmol·L^-1、19.10mmol·L^-1,微量元素MoO4^2-、Zn^2+、BO3^3-、Co^2+、Cu^2+、I^-、Mn^2+分别为3.0μmol·L^-1、0.06mmol·L^-1、0.4mmol·L^-1、0.2μmol·L^-1、0.4μmol·L^-1、10μmol·L^-1、0.2mmol·L^-1,附加KT0.2mg·L^-1。在此培养条件下,大花金挖耳细胞培养物中黄酮含量达到2.05%,是基本培养基的1.68倍;黄酮产量为517.87mg·L^-1,是基本培养基的1.80倍。【结论】在前期研究的基础上,通过培养基主成分优化,提高了大花金挖耳细胞培养生产黄酮的产量,初步得到了黄酮生产培养基。

大花金挖耳培养细胞总黄酮提取工艺及抑菌活性研究

为优化大花金挖耳细胞培养物总黄酮提取条件并初步测试细胞培养物抑菌活性。本文在考察不同干燥方式、溶剂、粉碎度和固液比等单因素对培养物总黄酮提取效果的基础上,采用L9(34)正交试验优化了振荡提取时间、超声波功率、超声波处理时间对培养物总黄酮提取工艺,并采用菌丝生长速率法测定了细胞培养物抑菌活性。结果表明,大花金挖耳培养细胞的黄酮含量显著高于培养液;室温下以丙酮为最佳提取溶剂;烘干和冷冻干燥对大花金挖耳胞内总黄酮的得率没有显著差异;样品粒度40~60目,固液比1:10~1:15(g/mL),超声提取(功率600 W、60min)1次后,再摇床振荡提取(18 h)1次,胞内黄酮的得率达1.22%,该方法简单,耗时短。抑菌试验表明,大花金挖耳悬浮培养细胞的乙醇粗提物对供试8种病原菌有不同程度的抑菌作用,在药液浓度50 mg/mL时,抑制率达到50%以上的供试病原菌有辣椒疫霉、苹果炭疽和小麦纹枯等3种病原菌。本研究为大花金挖耳细胞培养抑菌活性物质的提取工艺提供了参考。

大花金挖耳药学研究概况

在广泛文献检索基础上,对大花金挖耳的种属、历史、应用情况、成分、药理和临床应用等进行综述,为其进一步开发和利用提供资料。

大花金挖耳中单萜类化学成分的研究

目的研究大花金挖耳Carpesium macrocephalum全草的化学成分。方法采用硅胶、ODS、Sephadex LH-20等色谱方法进行分离纯化,根据理化性质、波谱数据以及X-射线单晶衍射方法鉴定化合物的结构。结果从大花金挖耳丙酮提取物中分离得到5个百里香酚类单萜,分别鉴定为（Z）-10-异丁酰氧基-9-氯-8,9-二羟基百里香酚（1）、9-异丁酰氧基-7,8-环氧-百里香酚异丁酸酯（2）、8-羟基-9-异丁酰氧基-10（2）-甲基丁酰氧基百里香酚（3）、8,10-二羟基-9-异丁酰氧基百里香酚（4）、10-异丁酰氧基-8,9-二羟基百里香酚（5）。结论化合物1为新化合物,命名为大花金挖耳素;化合物2~5为首次从该属植物中分离得到。