Transcriptome analysis reveals immune-related genes in tissues of Vibrio anguillarum-infected turbot Scophthalmus maximus

Turbot Scophthalmus maximus is an important mariculture fish species with high economic value.However,the bacterial diseases caused by Vibrio anguillarum infection bring huge economic losses to the turbot aquaculture industry.To understand the immune response of the turbot against V.anguillarum infection and to explore novel immune-related genes,the transcriptome analysis of turbot spleen and gills were conducted after V.anguillarum infection.Differentially expressed genes(DEGs)were identified in spleen and gill of the turbot amounted to 17261 and 16436,respectively.A large number of immunerelated DEGs were enriched in cytokine-cytokine receptor interaction signaling pathway,and the others by the kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)enrichment.The gene ontology(GO)classification analysis revealed that V.anguillarum infection had the greatest effect on biological processes and cellular components.Twelve immune-related DEGs were identified in the spleen(cstl.1,egfl6,lamb21,v2rx4,calcr,and gpr78a)and gills(ghra,sh3gl2a,cst12,inhbaa,cxcl8,and il-1b)by heat map.The proteinprotein interaction(PPI)networks were constructed to analyze the immune mechanism.The results demonstrate that the maturation and antigen processing of major histocompatibility complex(MHC)class II molecule,and calcitonin-or adrenomedullin-regulated physiological activity were important events in the immunity of turbot against V.anguillarum infection.In the gills,the protein interactions in TGF-βsignaling pathway,production of inflammatory factors,and endocytosis regulation were most significant.Our research laid a foundation for discovering novel immune-related genes and enriching the knowledge of immune mechanisms of turbot against V.anguillarum infection.

大菱鲆(Scophthalmus maximus)一种CXC趋化因子的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到一种CXC趋化因子。它的全长cDNA含有一个81bp的5’UTR,一个414bp的开放阅读框和一个449bp的3’UTR。开放阅读框编码了137个氨基酸残基。经过PCR扩增发现,该CXC趋化因子基因内含有4个外显子和3个内含子。RT-PCR分析表明,大菱鲆CXC趋化因子在正常脾脏和头肾中表达强烈;在胚胎的不同发育时期,大菱鲆CXC趋化因子从体节期开始才有微弱的表达。大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染后6h也有强烈的表达。这些结果表明该CXC趋化因子在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。

进口大菱鲆Scophthalmus maximus L.苗种的遗传结构分析

利用随机扩增多态性DNA(RAPD)和微卫星两种分子标记技术分析了从法国 (F)、英国 (E)、西班牙 (S)引进我国的三个大菱鲆群体的遗传结构。 2 0个RAPD随机引物对每个群体各 2 0尾大菱鲆的基因组DNA进行扩增 ,共获得 1 2 5个重复性好且谱带清晰的RAPD标记 ,片段大小在 2 0 0— 2 5 0 0bp之间 ,三群体的多态位点比例在 1 2 80 %— 2 0 0 0 %之间 ,Nei基因多样性指数在 0 0 1 42— 0 0 35 2之间 ,Shannon多样性指数在 0 0 4 2 3— 0 0 72 0之间。微卫星引物的分析结果与RAPD一致。总体上 ,三个群体的遗传多样性均较低 ,其中西班牙群体遗传多样性水平最高 ,英国群体次之 ,而法国群体最低。利用Shannon多样性指数和Nei多样性指数估算群体遗传变异的来源 ,两者得出一致的结论 :群体间遗传分化很弱。AMOVA分析结果进一步证实了Shannon多样性指数和Nei基因多样性指数的分析结果 :群体的遗传变异有 97%以上是由群体内个体间的遗传变异引起的 ,遗传变异主要来自于群体内个体间 ,显著性检验表明群体间的变异对总变异的影响不显著。

大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)胚胎及仔稚幼鱼发育研究

采用体视镜对大菱鲆胚胎期发育全过程进行连续观察 ,研究其胚胎正常发育特征 ,并继续对胚后期的仔、稚、幼鱼发育阶段采用测量、手绘、照相等方法进行形态学与生态学研究。结果表明 ,大菱鲆胚胎发育与其他硬骨鱼浮性卵鱼类基本相似 ,属端黄卵 ,盘状分裂。在水温 1 3℃条件下 ,约经 1 1 6h完成孵化。胚后仔、稚、幼鱼阶段 ,体背部色素逐步增深 ,鱼体逐渐由透明变为不透明 ,由两侧对称变为不对称。 3日龄仔鱼开口 ;1— 9日龄仔鱼 ,体色呈红色 ,称之为“红苗” ;1 0— 2 4日龄 ,黑色素增多 ,称之为“黑苗” ;2 5日龄以上 ,体披大量花状色素 ,称之为“花苗” ,由此鱼体变宽 ,右眼开始上升 ;30日龄苗 ,右眼已上移至头顶背部 ;35— 38日龄苗 ,右眼已完全转移至左侧 ,变态完成而达鲆鲽类所特有的形态、生态和生理状态 ;60—90日龄苗 ,背部正常体色为沙色 (sandcolor) ,全长已达 5 0— 60mm ,可以作为商品苗出售。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)四个不同地理群体数量形态特征比较

采用聚类分析、单因子方差分析和主成分分析方法,对4个不同地理群体大菱鲆进行了12项形态性状的测定,比较了4个群体的外部形态特征。聚类分析结果表明,4种大菱鲆群体中,丹麦和挪威之间及英国和法国之间的差异较小,丹麦、挪威和英国、法国之间的差异较大。方差分析多重比较结果表明,4个群体在部分形态特征上表现出明显差异,其中,英国和法国群体、挪威和丹麦群体之间形态特征差异显著指标较少,丹麦群体和英国群体、丹麦群体和法国群体、挪成群体和英国群体、挪威群体和法国群体之间差异显著指标较多。主成分分析构建了3个反映形态特征信息的综合性指标——主成分1、主成分2和主成分3,三者的贡献率分别为38.663%、14.117%和8.976%,三个主成分的累积贡献率为61.756%.分析结果显示,英国和法国群体、挪威和丹麦群体之间形态差异不显著,丹麦群体和英国群体、丹麦群体和法国群体、挪威群体和英国群体、挪威群体和法国群体之间形态差异显著,且差异主要来源于主成分1,而主成分1主要由经方差分析多重比较差异显著的指标组成,显然,主成分分析与聚类分析、方差分析的结论基本上是类似的,它们从不同的角度反映了群体间的形态学差异.

大菱鲆(Scophthalmus maximus)大规模家系选育优良家系的生长发育规律

运用Logistic、Gompertz和von Bertalanffy3种生长模型分别对大菱鲆的5个优良家系E♂1×E♀2、F♂4×N♀3、F♂2×E♀4、E♂2×F♀1、F♂1×F♀4及对照组群体的生长曲线进行了拟合和比较分析。结果表明,家系E♂1×E♀2、F♂2×E♀4和E♂2×F♀1的最优拟合模型为Gompertz模型,家系F♂4×N♀3和F♂1×F♀4的最优拟合模型为vonBertalanffy模型,而对照组则更适应于Logistic模型拟合其生长曲线。不同月龄家系的瞬时生长率均高于对照组,大多数相对生长率高于对照组,拐点月龄均较对照组拖后,拐点体重均高于对照组,快速生长区间的始速点均比对照组提前,快速生长区间长度均大于对照组。瞬时生长加速率在不同月龄则存在较大变化。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐高温品系选育及耐温性能评估

采用家系选育方法,进行了大菱鲆耐高温性状选育研究,对两代家系耐温性能进行测定,并利用bCOX回归分析了各家系的耐温性优势比。结果表明:各家系耐温性差异达到了显著水平(P<0.05),并且耐高温能力的优势比也存在显著差异,这反映出在大菱鲆耐高温选育中家系选择的高效性;经过一代选育,获得4个耐高温家系,并据此构建选育二代家系。耐温性能评估,选育二代比一代有显著提高,在27℃高温条件下,选育一代的平均死亡率为49%,选育二代的平均死亡率为10.26%;28℃条件下,选育二代耐高温子代的平均死亡率为32.83%,对照组的平均死亡率为88.9%;经过筛选后,选育二代的耐温性比选育一代提高了1—2℃左右。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼生长性状的遗传力及其相关性分析

以4种不同地理群体大菱鲆为亲本,采用巢式设计方法和人工采卵授精技术,按照1雄配2雌的原则,构建了28个父系半同胞家系和56个母系全同胞家系,分别测定了每个母系生长到6月龄的全同胞个体60个后代的体长、全长、体高、体重,应用数量遗传学原理,利用全同胞资料,采用方差、协方差分析的方法,研究了大菱鲆6月龄生长性状的遗传力及性状间的遗传相关和表型相关。对性状遗传力研究结果表明,雌性遗传方差组分均大于雄性遗传方差组分,雌性遗传方差组分存在显著的母性效应。基于父系半同胞组内相关法估计的遗传力是大菱鲆体长、全长、体高、体重遗传力的无偏估计值,估计的遗传力准确可靠,估计值分别为0.282、0.251、0.283、0.450,为中高等遗传力,显示对大菱鲆生长性状进行选择育种具有很大的潜力。对性状间相关性分析结果表明,依据父系半同胞遗传协方差组分和表型协方差分别估计体长-全长、体长-体高、体长-体重、全长-体高、全长-体重、体高-体重间的遗传相关和表型相关,遗传相关在0.888—0.985,表型相关在0.864—0.957,各性状间遗传相关和表型相关经t检验均达到极显著水平(P<0.01)。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)选育家系的构建和培育技术研究

采用巢式设计方法和人工采卵授精技术,对大菱鲆大规模家系的构建与培育技术进行研究。按照1雄配2雌的原则,选取英国、法国、丹麦和挪威4个群体的大菱鲆进行定向交配,并对大菱鲆早期发育阶段苗种进行了环境标准化和一级、二级、三级数量标准化培育。结果表明,构建父系半同胞家系的初始成功率不高,1/3父系半同胞家系的初始构建成功率≤20%;由于家系成功初始构建的不同步性,拉长了家系的培育时间,对同一发育阶段家系早期培育的同步性较差,导致对处于同一发育阶段、但在不同时期培育的家系所进行的环境标准化效果不好,每次数量标准化时,存在部分全同胞家系间数量差异显著。基于早期阶段家系构建和培育存在的问题,提出了拟解决的方法和对策,为大规模建立大菱鲆家系提供参考。

蛹肽蛋白替代鱼粉对大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼生长、饲料利用、消化代谢酶及免疫性能的影响

选取蛹肽蛋白分别替代大菱鲆幼鱼配合饲料中0、15%、30%、45%、60%、75%的鱼粉,配制成6种等氮等能的饲料饲喂大菱鲆幼鱼(19.84±0.04 g)56 d,以研究蛹肽蛋白替代鱼粉的效果。结果显示,大菱鲆幼鱼的特定生长率、饲料效率随替代水平的升高而降低,30%及以上替代组显著低于对照组(P<0.05);鱼体粗蛋白、粗脂肪水平随替代水平的升高而降低,分别在75%和30%及以上替代组显著降低,鱼体水分和灰分含量随替代的升高而升高,分别在75%和30%及以上替代组显著升高(P<0.05)。摄食率随替代水平升高呈先上升后下降的趋势,在30%替代组呈现出最高的摄食率,且显著高于对照组(P<0.05)。饲料干物质的表观消化率在42.53%-54.36%之间,且当替代水平达到75%时显著低于对照组(P<0.05);而蛋白质表观消化率在71.67%-86.89%之间,仅45%和75%替代组显著低于对照组(P<0.05)。各替代组肝脏超氧化物歧化酶活性均高于对照组,在45%和60%替代组出现显著性差异(P<0.05)。综上所述,蛹肽蛋白可以替代大菱鲆幼鱼饲料中15%的鱼粉而不影响其生长摄食、饲料利用以及与消化、代谢、免疫相关的酶的活性。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)不同生长阶段体重的遗传参数和育种值估计

采用非求导约束最大似然法(DFREML)进行了大菱鲆不同生长阶段体重的遗传参数和育种值研究,每一生长阶段分别对4种不同动物模型估计遗传参数的差异进了比较。不同模型中对全同胞家系效应和日龄协变量作了不同的考虑:模型A,不考虑全同胞家系效应和日龄协变量;模型AD,仅考虑日龄协变量;模型AF,仅考虑全同胞家系效应;模型AFD,同时考虑全同胞家系效应和日龄协变量。结果表明,6月龄利用模型AF,3月龄、9月龄、12月龄、15月龄利用模型AFD对遗传参数和育种值进行估计较为适合。利用育种值选择和表型值选择两种方法分别进行了家系选择和个体选择的效率比较,结果表明,在每一生长阶段依据育种值选择的效率均高于表型值选择的效率。利用不同生长阶段的家系育种值以及亲本育种值分别进行了家系选择比较和亲本选择比较,结果表明,在不同生长阶段,按家系、父本和母本的育种值分别排序,前50%的相同率和育种值的相关系数均为9—12月龄较6—9月龄的提高幅度比其它相邻阶段显著增加,推测家系提前筛选的时间以及父本和母本选择的时期均不低于9月龄。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)细菌性疾病的研究现状

由弧菌科的细菌和其引发的细菌性疾病被认为是目前大菱鲆养殖业的主要危害之一。本文详细介绍了弧菌属的病原及一些典型的发病症状。对其他科属的一些病原菌 ,也作了相应描述 ,但它们的致病力相对弧菌科的病原菌致病力要弱 ,危害范围要小。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)家系选育F_2早期选择反应和现实遗传力估计

为了评估大菱鲆选育F2的早期育种效果,采用3种方法,即,Ⅰ:比较F2选择系和对照系的最小二乘均值,Ⅱ:比较连续2代(F1和F2)选择系目标性状间的育种值,Ⅲ:比较F2选择系和对照系的育种值,估测了6月龄大菱鲆体重的选择反应,并进而分析了现实遗传力和遗传增益。结果表明,3种方法的选择反应估测值存在一定差异,其相应估测的现实遗传力和遗传增益也不相同;3种方法估测选择反应、现实遗传力和遗传获得的均值分别为3.1983±0.5880、0.2941±0.0531和8.70±1.60,显示出足够大的早期选择反应、中等的现实遗传力和较低的遗传获得,预示利用家系选育对大菱鲆进行遗传改良能够取得良好的育种成效,同时,这些群体还有很大的遗传改良潜力。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长性状相关的微卫星标记筛选

采用分群分离分析法,以同一批受精卵孵化的同池养殖大菱鲆生长性状发生分离的群体为材料,进行微卫星DNA遗传分析,以揭示影响大菱鲆生长发育速度方面的遗传信息。30个多态性微卫星位点对生长高值组(F组)和生长低值组(S组)各10个样本建立的DNA混合池进行扩增时,在两池间出现了7个差异片段。通过对两组大菱鲆个体PCR扩增出的差异条带进行统计,分析微卫星位点与大菱鲆生长性状的相关性。结果表明,有1个微卫星位点(SmaC10)在355bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在一定的负相关性;有4个微卫星位点(SmaC02、SmaC06、SmaC09、B11-I12/6/3)分别在258bp、182bp、226bp、175bp的等位基因片段与大菱鲆生长性状存在正相关性,其中位点Smac09在226bp的等位基因片段与生长性状的正相关性极显著,相关系数达到0.354。位点SmaC09所扩增出的等位基因片段可作为具有良好生长特性人工选育群体的分子标记,指导大菱鲆的辅助育种。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)胚胎发育的形态学和组织学研究

采用显微镜和连续切片技术,观察了大菱鲆胚胎发育阶段的形态学和组织学特征。结果表明,大菱鲆胚胎发育主要经历6个时期;在14℃,胚体经108h即可孵化出膜。胚胎在64细胞期出现纬裂,分裂球分化为外层的包被层和内部的深层细胞;多细胞期形成卵黄合胞体层;低囊胚期形成囊胚腔。受精后26h30min胚盾出现。胚盘下包65%时,头突出现;下包90%时,神经索和体节形成;下包完全时,脊索原基形成。受精后59h35min,克氏囊出现;72h消化管出现;74h前肾小管形成;82h脊索部分细胞发生"真空化";89h克氏囊退化消失,胚胎消化管的后端出现纤毛;94h胚体的心跳开始。初孵仔鱼鳍褶上形成特有的色素丛。

微卫星标记在大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)家系系谱印证中的应用研究

用8个微卫星标记对大菱鲆7个人工选育家系进行了系谱鉴别和遗传多样性研究。8个微卫星位点的平均多态信息含量为0.6721,平均杂合度为0.7206。8个微卫星位点在7个家系分析中,共检测到40个等位基因,每个位点的等位基因数在38个之间,每个位点平均有5个等位基因。根据已知亲本及子代基因型,成功的推断出了7个家系中缺失亲本的基因型。在双亲未知的情况下8个微卫星位点累积排除概率是97.07%,已知单亲时累积排除概率达99.63%。用UPG-MA法对7个家系的137个子代个体进行了聚类分析,90.5%同一家系的子代个体能完全聚类到一起,分类结果与系谱来源基本一致。微卫星标记可以为大菱鲆混养家系进行亲权鉴定和系谱构建提供技术支持。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)病原鳗利斯顿氏菌的鉴定

采用表观分类学及分子生物学方法,对从大菱鲆细菌性败血感染症的病(死)鱼中分离到的相应病原菌,进行了形态特征、理化特性等较系统的鉴定及代表菌株DNA中G+Cmol%的测定;同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明,所检30株菌均为利斯顿氏菌属(ListonellaMacDonellandColwell1986)的鳗利斯顿氏菌[L·anguillarum(Bergeman1909)MacDonellandColwell1986],择S010610-1株、S010610-3株及S010623-1株作为代表菌株进行的16SrRNA基因序列测定,不包括引物结合区,所扩增的16SrRNA基因序列长度,S010610-1株为1466bp(GenBank登录号:AY963630)、S010610-3株为1416bp(GenBank登录号:AY963631)、S010623-1株为1424bp(GenBank登录号:AY963632),与GenBank数据库中弧菌属细菌的同源性在97%—99%。

海水工厂化养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)和褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)腹水病病原菌的分离与鉴定

从患腹水病大菱鲆和褐牙鲆成鱼体内分离到两株致病作用强的病原菌FS1和FS2,经人工感染实验表明菌株FS1和菌株FS2为腹水症的致病菌。采用常规的生理生化鉴定方法及梅里埃全自动微生物分析系统(VITEK32),结合分子生物学方法进行病原菌的鉴定。结果表明,菌株FS1和菌株FS2分别为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。菌株FS116SrRNA基因序列与迟缓爱德华氏菌的同源性达99%;菌株FS2的16SrRNA基因序列与溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等的同源性均达99%。为最终确定菌株FS2的分类地位,测定了其HSP60基因序列,进行网上同源性比对。分析结果表明,菌株FS2与溶藻弧菌的同源性达99%,而与其他弧菌HSP60基因的同源性均低于91%。这两种致病菌混合感染或分别感染均可造成养殖鲆鱼腹水病。

大菱鲆(Scophthalmus maximus L)养殖现状与可持续发展

大菱鲆(ScophthalmusmaximusL)的良种优势地位已在我国确立,工厂化养殖的初级模式已经形成并获得普遍推广;规模化养殖和成鱼市场的不断扩大,将我国推进到世界大菱鲆养殖和消费大国行列;“大菱鲆效应”对我国海水工厂化养殖发展和沿海“三农”经济的拉动作用很大,也为我国海水工业化养殖奠定了理论和实践基础;当前由大菱鲆养殖产业的迅速发展而带来的机遇和挑战,正推动着我国海水工厂化养鱼朝良种化、规范化、国产化全封闭式的高级阶段攀登。

养殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腹水病的病原多样性及其耐药性分析

为了解引起养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性情况,针对2002–2010年由不同地区病样分离的27株细菌性病原进行了16S r DNA鉴定,并采用K-B法测定了27株细菌对22种抗生素的耐药性,分析了病原菌的耐药谱及耐药率变化。结果显示,大菱鲆腹水病病原菌主要有大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas espejiana)。山东青岛地区以大菱鲆弧菌为主,威海地区以迟钝爱德华氏菌为主,烟台地区菌株种类分布平均。5类细菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、复方新诺明耐药率高于50%。只有1株迟钝爱德华氏菌对氟苯尼考产生了耐药,其余菌株对其均没有耐药性,且在长期使用中不易产生耐药性,证实氟苯尼考为当前防治腹水病的一种良好抗菌药物。27株病原菌的耐药谱数量为27个,每个菌株具备自己独特的耐药谱,74.1%的菌株对10种以上的抗菌药物产生了耐药性,均有多重耐药性。