大菱鲆红体病虹彩病毒体外增殖条件的研究

探讨大菱鲆病毒疫苗的研制,以牙鲆鳃细胞(FG细胞)为增殖体系,利用细胞病变效应(CPE)为判断指标,对大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)的体外最适增殖条件等进行了研究。结果表明,病毒接种量、病毒吸附时间、细胞培养条件对TRBIV的体外增殖均有明显的影响,以0.2 mL病毒液接种FG细胞、吸附2 h、用含10%胎牛血清的MEM培养液于22℃培养时,病毒的增殖速度最快。研究还发现,病毒的收获时间和病毒液冻融次数对所得病毒的感染力均有显著影响,在最佳增殖条件下,病毒在FG细胞中增殖至第4天时进行收获,且只冻融1次,其感染活性最强,反复冻融后病毒的感染活性会显著降低。

大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的重组分泌表达

依据大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot viral reddish body iridovirus,TRBIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列,设计了一对特异性引物,并在正反向引物中分别引入EcoR I和Not I酶切位点,从而将PCR扩增得到的TRBIV MCP基因双酶切后定向克隆到真核表达载体pGAPZαA的GAP启动子的下游位点,并电转化入大肠杆菌DH5α宿主菌内。经抗生素Zeocin筛选、PCR、EcoR I和Not I双酶切以及测序分析,构建了含有α-factor信号肽的真核重组表达载体pGAPZαA MCP。重组表达质粒pGAPZαA MCP经Avr Ⅱ单酶切后电转导入毕赤酵母X-33中,挑选阳性克隆,提取表达上清经SDS-PAGE和Western-blot免疫印迹分析。结果显示,TRBIV MCP基因在酵母中成功实现分泌表达。阳性重组酵母菌经过72h诱导培养后,重组TRBIV MCP的表达量高达60.2μg/ml左右。

大菱鲆红体病虹彩病毒ATPase基因的克隆与序列分析

克隆了大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)的重要功能蛋白--腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatease, ATPase)基因的全部编码区及其上下游部分的核苷酸序列.经多序列比对和分析发现,TRBIV与GenBank中6种代表性虹彩病毒的同源性介于35%～98%之间.绘制出的包含TRBIV在内的14种虹彩病毒的系统发育树证实,TRBIV是一种新的鱼类虹彩病毒,其分类地位处在虹彩病毒科待指定病毒属内的真鲷虹彩病毒亚群和传染性脾肾坏死病毒亚群之间.

我国养殖大菱鲆病毒性红体病及其流行情况调查

大菱鲆病毒性红体病(Viral reddish body syndrome, VRBS)是一种新发现的感染我国养殖大菱鲆的流行性疾病.本文描述了病鱼的外观症状和解剖病理特征,报道了该病的病原及疾病流行情况调查结果.外观检查发现,病鱼的体表无明显损伤,但腹面沿脊椎骨附近皮下淤血、发红,鳍及鳍基部充血、发红;病鱼贫血,血液凝固性差;肾脏肿大,呈灰白色.组织病理学研究显示病鱼脾组织中存在大量肥大细胞,电镜切片中可见大量平均直径约125 nm的二十面体病毒粒子,即大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus, TRBIV).将过滤除菌的含TRBIV的病鱼脾组织匀浆液,经腹腔注射进行人工感染,感染鱼在3周内的累积死亡率达85.7%,死亡大菱鲆表现出腹面和鳍边发红等外观症状,并在感染鱼脾组织切片中观察到大量同样的病毒粒子,由此证实TRBIV是我国养殖大菱鲆病毒性红体病的病原.疾病流行情况调查显示,该病多在养成期大菱鲆中流行,高发季节为每年的8～12月.

我国大菱鲆病毒性红体病的研究进展

大菱鲆病毒性红体病的频繁暴发给我国大菱鲆养殖业造成了严重的危害,本文将综述我国大菱鲆病毒性红体病及其病原虹彩病毒的研究进展,旨在为病毒性红体病的防治提供一定的理论基础。

大菱鲆3种病原性红体病的流行性调查研究

为分析大菱鲆红体病暴发的病原及红体病和养殖环境温度的相关性，于2011年3月-2012年1月的不同季节，在胶东半岛沿海多个养殖场收集大菱鲆红体病病鱼，采用光镜观察、弧菌选择性培养、电镜观察（负染和切片）、鱼类细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）检测以及PCR特异性扩增方法，观察其病理症状，分析、鉴定其致病病原。研究发现，所检各批次大菱鲆红体病鱼都不是寄生虫感染；环境温度较高时，一般为细菌性红体病（弧菌感染）；环境温度较低时，可检测到病毒性红体病，并发现有弧菌和病毒混合感染的病例；鳃丝是否灰暗贫血是区分细菌性红体病和病毒性红体病的最直接有效的鉴别病症。研究结果对于有效监控大菱鲆红体病的暴发，快速鉴别致病病原，实现对症治疗有重要意义。

海水养殖鱼类中虹彩病毒无症状感染的套式PCR分析

大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是中国和韩国养殖大菱鲆的主要病毒性病原。本研究依据TRBIV的腺苷三磷酸酶(Adenosine triphosphatease,ATPase)基因序列,设计了特异性的引物,建立了一种检测TRBIV的套式PCR方法,该方法检测TRBIV的灵敏度大约为一步PCR的104倍。应用该方法对6种中国常见海水养殖鱼类进行TRBIV感染情况调查,在无明显发病症状的黑鲪(Sebastodes fuscescerns)、宽体舌鳎(Cynoglossus robustus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)和非洲黑石斑鱼(Alphestes afer)4种鱼类中,扩增出长度约为471bp的特异性DNA片段。对这些来自于不同鱼类的DNA片段进行测序和序列比对后发现,它们之间完全相同,且与TRBIV的ATPase基因序列有100%的同源性。研究结果表明,在这4种海水养殖鱼类体内存在TRBIV的无症状感染,它们可能也是TRBIV的宿主。

养殖大菱鲆细菌性红体病病原菌的分离与鉴定

从患有红体病的养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)的肌肉中分离得到一株优势菌并记为H1。经人工注射感染证实H1即为引起养殖大菱鲆红体病的病原菌,其半致死量LD50为2.82×105CFU/mL,而低浓度(1.41×103CFU/mL)没有造成死亡,但注射部位有脓肿现象,注射相同体积1.5%无菌生理盐水的对照组没有明显的症状,注射部位也无异常。革兰氏染色显示该菌为革兰氏阴性,菌体呈杆状,周生鞭毛。综合该菌的形态、常规生理生化特征和API32E鉴定结果,发现H1与迟钝爱德华氏菌的表性特征非常相似,相似率达到99.9%。在分子水平上对其16S RNA基因序列的测定、同源性分析,结果表明H1与迟钝爱德华氏菌的亲缘关系最近,相似度达到99%。综合上述研究结果,将该菌株初步鉴定为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。