大蒜花叶病毒外壳蛋白基因cDNA的克隆和序列分析

我们从自然发病的大蒜中分离得到了大蒜花叶病毒。以其基因组ＲＮＡ为模板合成了３＇末端部分ｃＤＮＡ。从中选出一批插入片段在２．０ｋｂ以上的重组克隆，经Ｎｏｒｔｈｅｒｎ点杂交分析证实了所选克隆与基因组ＲＮＡ同源。通过对若干个克隆的插入片段两端部分序列的测定，选出一个克隆ｐＧＭ４９５，其插入片段的长度约为２．４ｋｂ，３′末端存有一个Ｐｏｌｙ（Ａ）结构，它应包含了编码该病毒外壳蛋白全部序列。序列测定的结果表明，这个ｃＤＮＡ片段全长为２３７９ｂｐ，其中含有与酶切图谱分析结果相符的ＥｅｏＲＩ、ＰｓｔＩ及ＢａｍＨＩ酶切位点。第一个终止密码子ＴＡＡ与３′ｇ末端相距２６４ｂｐ，我们根据碱基序列推定的氨基酸序列与其它已发表的Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ的外壳蛋白氨基酸序列以及外壳蛋白翻译后加工的蛋白酶专一切点相比较后推测，编码该病毒外壳蛋白序列可能起始于３′末端上游的１１７０ｂｐ处，共编码３０２个氨基酸，其分子量为３６ｋＤ，略大于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ所测定的３３ｋＤ，非编码区域长２６４ｂｐ，富含ＡＴ，并有多个终止密码子的存在。趾３′末端３２～２７ｂｐ处有一个ＡＡＴＡＡ序列。

两株大蒜病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用建立cDNA库的方法 ,通过RT PCR分别扩增和克隆了感染我国天津地区大蒜的大蒜花叶病毒 (GMVc)和大蒜潜隐病毒 (GLVc)的外壳蛋白 (CP)基因 ,并对其分别在原核细胞中进行了诱导表达和表达产物的分析。克隆基因的序列测定与分析表明 ,GMVc的CP基因全长 867个核苷酸 ,编码 2 89个氨基酸 ,与报道的一株GMV的核苷酸和氨基酸的同源性分别为 88 5%和 97 2 % ,属于马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)的成员 ;GLVc的CP基因全长 885个核苷酸 ,编码 2 94个氨基酸 ,与报道的一株GLV的核苷酸和氨基酸同源率分别为 73 6%和 90 9% ,属于香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus)的成员 ;克隆基因的表达产物经SDS PAGE分析表明 ,GM Vc和GLVc的外壳蛋白分别约 32kD和 34kD ,与预测的结果一致。本实验结果对感染我国大蒜的病毒进行分子水平的确切诊断、分类和调查奠定了基础 ,将对大蒜病毒病的防治与脱毒大蒜的生产具有重要的意义。