中蜂敌害大蜡螟绿色防控技术

大蜡螟属鳞翅目(Lepidoptera)、螟蛾科(Pyralidae)、蜡螟亚科(Galleriinae),是中华蜜蜂Apis cerana cerana Fabricius (简称“中蜂”)的主要敌害。大蜡螟幼虫(又称巢虫或绵虫)以蜡屑为食,破坏蜜蜂巢房,取食蜂蜜、花粉和蜜蜂幼虫茧衣,造成大量幼虫和蛹的死亡,危害世界各地蜂群[1-3]。1只大蜡螟成虫一次可产卵600-1500粒,温度适宜时卵经过3 d就能孵化成幼虫[4-6,19]。

噬菌体PCCM_KpP1172的鉴定及其对大蜡螟幼虫碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌感染的疗效评估

背景碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌感染发生率逐年增加,临床治疗困难,死亡率高。使用具有高裂解能力的噬菌体治疗细菌感染是颇具前景的治疗方法。目的针对碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌分离一株新型裂解性T7噬菌体,对该分离株进行生物学特性测定和基因组学测序分析,为临床开展噬菌体治疗提供可应用的噬菌体资源。方法从肺部感染患者的痰液中分离出肺炎克雷伯菌,通过细菌鉴定、药敏分析、全基因组测序和PCR检测验证菌株的毒力基因与耐药基因,以此株肺炎克雷伯菌为宿主菌,在污水中分离出一株裂解性噬菌体,命名为PCCM_KpP1172。测定该噬菌体生物学特性,分析其基因组序列,并通过大蜡螟幼虫感染模型检测该噬菌体的治疗效果。结果该株肺炎克雷伯菌基因组分析存在耐药基因与毒力基因rmpA2、rmpA、iroN、icu。以此菌株为宿主菌分离到新型肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为PCCM_KpP1172,在宿主菌菌苔上可形成完全透明的噬菌斑并伴晕圈;透射电镜下呈现有尾噬菌体目短尾病毒科病毒的典型形态特征;一步生长曲线显示其潜伏期为15 min,最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.0001,对ST11KL64型肺炎克雷伯菌有广泛裂解范围。基因组分析显示,该噬菌体为双链DNA(总长度为40222 bp),G+C含量为53%,基因组包含49个开放阅读框(open reading frames,ORF),无毒力或抗生素耐药性相关基因。基于系统发育分析,该噬菌体可归属于有尾噬菌体目Studiervirinae亚科Przondovirus属的一个新种。此外,噬菌体PCCM_KpP1172可在体外3 h内有效抑制碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的生长,并能提高宿主菌感染的大蜡螟幼虫存活率(P<0.01)。结论本研究针对碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌分离并鉴定了一株新的T7噬菌体PCCM_KpP1172,具有高裂解力,无耐药基因和毒力基因,对大蜡螟幼虫感染模型具有良好治疗效果。

大蜡螟性肽受体基因GmelSPR克隆及表达分析

交配是昆虫繁衍的重要方式,雌性交配后会显现出一系列保护后代而产生的行为,SPR则是重要的交配行为调控受体基因。本研究根据前期转录组SPR基因数据信息,利用RT-PCR扩增出大蜡螟SPR基因的完整CDS序列,命名为GmelSPR(GenBank登录号:OR347698)。生物信息学分析显示该基因编码区全长1263 bp,编码420个氨基酸,预测分子量48.70718 kDa,理论等电点8.70,有7个跨膜螺旋区,具有典型G蛋白偶联受体蛋白特征。系统进化树比对结果显示大蜡螟GmelSPR与螟蛾科昆虫脐橙螟Amyelois transitella、印度谷螟Plodia interpunctella置信度较高。大蜡螟不同状态、不同组织中表达分析表明,未交尾雌蛾、雄蛾和已交尾雌蛾、雄蛾GmelSPR均在头部较高表达,且在未交尾雌蛾、雄蛾中表达量均高于已交尾雌蛾、雄蛾。本研究克隆了大蜡螟SPR基因,克隆结果表明GmelSPR与螟蛾科昆虫亲缘较近;表达谱分析则显示GmelSPR可能参与大蜡螟交配行为,为进一步研究大蜡螟中SPR基因功能奠定基础。

顺-3-己烯醇乙酸酯对大蜡螟的驱避作用

利用植物挥发物监测和调控害虫行为已逐渐成为害虫绿色防控的重要途径。顺-3-己烯醇乙酸酯广泛存在于瓜果及绿色植物的叶片中,具有环境友好、无残留的优点。大蜡螟是养蜂产业中常见的害虫,严重影响蜂产业和蜜蜂资源保护。为生产中应用顺-3-己烯醇乙酸酯调控大蜡螟的行为控制其对蜂群的危害提供依据,为开发新型昆虫行为调控剂以及大蜡螟的绿色防控提供支持,利用Y-型嗅觉仪研究大蜡螟不同虫态的个体对不同浓度、同一浓度不同剂量顺-3-己烯醇乙酸酯的行为趋性。结果表明,大蜡螟幼虫对顺-3-己烯醇乙酸酯表现出显著的负趋性,浓度为0.5 mol/L时,大蜡螟幼虫总选择率为79.33%,并表现为极显著的负趋性;雄成虫对顺-3-己烯醇乙酸酯的选择率为8.33%,具有显著的负趋性;不同剂量的顺-3-己烯醇乙酸酯对大蜡螟成虫的选择行为影响不显著,但对幼虫均具有明显的驱避效果。

取食不同聚乙烯材料对大蜡螟种群延续的影响

取食聚乙烯材料对大蜡螟种群延续的影响直接决定了大蜡螟取食并生物降解废弃聚乙烯塑料应用的可行性,为验证该影响规律,以农业中常用降解新膜(JJXM)、PE新膜(PEXM)、农田残留滴灌带(FDGD)、农田残膜(NTCM)为不同聚乙烯材料食物,人工饲料(RGSL,对照组)做对比,恒温30℃、相对湿度(RH)60%±10%RH条件下连续饲养大蜡螟两个世代。结果表明:取食不同聚乙烯材料较RGSL首先显著降低了大蜡螟取食量,进而显著降低了大蜡螟蛹重蛹长、成虫体重体长、产卵量、孵化率;第二代取食不同聚乙烯材料量均较第一代增加,而蛹重、蛹长、成虫体重、孵化率均低于第一代(P>0.05);不同聚乙烯材料处理产卵量由高到低依次为NTCM、FDGD、PEXM、JJXM;5龄期大蜡螟幼虫在不同聚乙烯处理条件下较RGSL处理总历期有缩短的趋势。

皮炎外瓶霉黑色素的致病力:基于大蜡螟感染模型的评估

目的 采用大蜡螟-皮炎外瓶霉模型评估皮炎外瓶霉黑色素的致病力。方法 采用“共生法”恢复皮炎外瓶霉白化株黑色素的生成,使用皮炎外瓶霉白化株、色素株及色素恢复株构建大蜡螟感染模型,观察最佳感染浓度下各组大蜡螟生存曲线、外观表现及组织病理学变化情况。结果 采用“共生法”可以恢复皮炎外瓶霉白化株黑色素的生成,孢子浓度10^(7)/mL为大蜡螟-皮炎外瓶霉模型的最佳感染浓度。观察终点时,白化株组存活率低于色素株组、色素恢复株组,生存曲线差异具有统计学意义(色素株组与白化株组:χ^(2)=6.11,P=0.013;色素恢复株组与白化株组:χ^(2)=6.37,P=0.010),而色素株组与色素恢复株组生存曲线的差异无统计学意义(χ^(2)=0.01,P=0.940)。组织病理学检查显示,与白化株相比,皮炎外瓶霉色素株及色素恢复株可吸引更多大蜡螟血细胞聚集,形成更大的感染性结节。结论 在蜡螟感染模型中,皮炎外瓶霉白化株表现出比色素株更强的致病力,恢复白化株黑色素的生成,可以逆转白化株致病力。

生物标志物联合大蜡螟感染模型在鉴别临床高毒力肺炎克雷伯菌中的应用

目的探讨生物标志物检测联合大蜡螟感染模型准确鉴别临床高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)的应用价值。方法非重复收集2020年1月至2021年12月徐州医科大学附属医院分离自重症监护室患者的肺炎克雷伯菌,经拉丝实验和毒力基因检测鉴定出生物标志物阳性的肺炎克雷伯菌,并进行荚膜血清分型和多位点序列分型。使用标准菌株ATCC700603、ATCC43816建立大蜡螟感染模型,将临床分离的肺炎克雷伯菌分别制作4个不同浓度的菌液进行大蜡螟感染试验,每12小时记录死亡情况,绘制生存曲线并计算72 h 50%致死量(LD_(50))。结果共收集15株hvKP,检出3种血清型,分别为K1 ST23型(13.3%,2/15)、K64 ST11型(60.0%,9/15)、K112 ST15型(26.7%,4/15)。K1和K64型的菌株均含有rmpA、rmpA2、iucA和iroN 4个毒力基因,而K112型的4株均只含有rmpA2和iucA 2个毒力基因。K64 ST11型和K112 ST15型菌株均对碳青霉烯类抗菌药物耐药。大蜡螟能够区分出高毒力和低毒力肺炎克雷伯菌,当菌液浓度分别为1×10^(5) CFU/mL、1×10^(6) CFU/mL、1×10^(7) CFU/mL、1×10^(8) CFU/mL时,ATCC700603和ATCC43816对应浓度比较,差异有统计学意义(P=0.0001、0.0023、0.0245、0.0428)。未做任何处理的空白对照和注射了磷酸盐缓冲液的大蜡螟均存活,随着菌液浓度的升高,大蜡螟的病死率也随之升高。与高毒力标准菌株ATCC43816相同,K1、K64、K112型临床菌株均表现出高致死率,当菌液浓度在1×10^(7)~1×10^(8) CFU/mL时,所有大蜡螟在48 h内死亡。1×10^(6) CFU/mL的菌液可区分出hvKP和cKP,差异均有统计学意义(P<0.05)。ATCC700603、ATCC43816、K1型、K64型、K112型和cKP在72 h的LD_(50)分别为5.2×10^(6) CFU/mL、6.8×10^(4) CFU/mL、1.0×10^(4) CFU/mL、1.0×10^(4) CFU/mL、3.1×10^(4) CFU/mL、1.6×10^(6) CFU/mL,对应的Log10LD_(50)分别为6.718、4.834、3.987、3.987、4.504、6.212,临床分离的K1型、K64型、K112型肺炎克雷伯菌均可被定为高毒力菌株。结论生物标志物联合大蜡螟感染模型,可以准确实现临床经典肺炎克雷伯菌和高毒力肺炎克雷伯菌的鉴别。

大蜡螟综合防治方法研究进展

大蜡螟(Galleria mellonella)是一种危害蜂群并对巢脾极具破坏性的害虫。受大蜡螟危害的蜂群,群势较弱,生产力下降以至蜂群飞逃,给养蜂业造成了极大的损失。大蜡螟综合防治研究,逐渐成为了研究热点。本文归纳和梳理了近年来国内外大蜡螟防治新技术,为大蜡螟综合防控提供新思路,为促进我国养蜂业持续健康发展奠定基础。

大蜡螟幼虫和成虫对不同蜜蜂巢脾的选择

为了探究大蜡螟幼虫和成虫对东、西方蜜蜂巢脾的选择偏好性及其机理,分别在蜂场和实验室放置两种蜜蜂的巢脾(巢脾带花粉和蜜),观察记录巢脾受大蜡螟的侵染情况。结果表明,在东方蜜蜂蜂场和西方蜜蜂蜂场,单独放置的东方蜜蜂巢脾平均2 d即受大蜡螟侵染严重,而单独放置的西方蜜蜂巢脾却不受大蜡螟侵染,一同放置的东、西方蜜蜂巢脾,平均2 d后东方蜜蜂巢脾遭受大蜡螟成虫侵染,5 d后大蜡螟幼虫转移侵染西方蜜蜂巢脾;在实验室,大蜡螟幼虫选择东、西方蜜蜂巢脾无显著差异。说明不取食的大蜡螟成虫基于嗅觉偏向选择东方蜜蜂巢脾,而取食巢脾的大蜡螟幼虫则对东、西方蜜蜂巢脾无选择性。

大蜡螟工厂化生产流程及环境因素的控制

为了寻找大蜡螟工厂化生产过程中的适宜环境条件 ,定量控制研究了幼虫期环境因素对大蜡螟合格产品的影响。结果表明幼虫期适宜的环境条件为温度 (2 9± 1)℃、相对湿度 5 0 %～ 70 %、虫口密度 30 0头 /盒 。

几种昆虫病原线虫对大蜡螟幼虫血淋巴及其能源物质含量的影响

用异小杆线虫(Heterorhabditisspp.)和斯氏线虫(Steinernemaspp.)处理大蜡螟5龄幼虫。结果显示:处理后12h昆虫血细胞开始变形、崩解,且血细胞数量急剧下降,到昆虫接近死亡时(24～32h左右),血细胞数比正常水平下降85%;处理后24h血淋巴总量下降73.61%,酯酶活性不断增强,蛋白含量明显高于对照,总糖含量降低14%～70%。上述结果表明:昆虫病原线虫的侵入破坏了寄主的防御系统,改变了寄主血淋巴能源物质含量。

大蜡螟幼虫的体色遗传规律

对大蜡螟Galleriamellonella幼虫不同颜色品系的普通遗传学分析表明 ,大蜡螟幼虫的体色遗传是常染色体遗传且符合复等位基因遗传规律。深黄色基因 (AA)对灰黑色基因 (BB)和灰色基因 (CC)为显性 ,深黄色基因 (AA)对白黄色基因 (DD)、灰黑色基因 (BB)对白黄色基因 (DD)和灰色基因 (CC)、灰色基因 (CC)对白黄色基因 (DD)为不完全显性。基因型为AD、BD、CD的个体 ,其表现型均为黄色 ;基因型为AA、BC的个体 ,其表现型均为深黄色。

嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40对大蜡螟幼虫体内酶活性和中肠组织的影响

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila在侵入到寄主昆虫血腔后能够成功地逃避或抑制寄主昆虫的免疫反应并快速杀死昆虫。为深入了解嗜线虫致病杆菌的杀虫机理,明确关键的致病因子,作者应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法,从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化了一种新的杀虫蛋白——Tp40,该蛋白对大蜡螟Galleria mellonella具有高血腔注射活性,对大蜡螟5龄幼虫的LD50为68.54ng/头。本文检测了该毒素对大蜡螟幼虫的致病特性,注射Tp40毒素后,大蜡螟幼虫表现出兴奋和痉挛等症状,当以不低于(70±0.02)ng/头的剂量注射Tp40,大蜡螟幼虫均在20min内死亡,但试虫的体色、血淋巴的颜色以及血细胞的形态没有发生明显的变化。对大蜡螟体内酶活性的测定结果显示,在注射LD50剂量的Tp40蛋白后,试虫体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活力都明显的高于对照(P<0.05),而酚氧化酶活力显著低于对照(P<0.05)。对大蜡螟幼虫中肠的组织病理学研究显示:这种42kDa蛋白能够破坏试虫的中肠组织,导致其肠壁细胞出现排列紊乱、脱落和围食膜消失。据此推测,Tp40与嗜线虫致病杆菌对寄主昆虫的免疫抑制有关,寄主中肠组织可能是其作用靶标之一。

东、西方蜜蜂对大蜡螟(Galleria mellonella L.)幼虫和成虫的清理行为差异研究

大蜡螟(Galleria mellonella.L)是一种遍及世界且对蜜蜂巢脾极具破坏性的害虫。为比较东、西方蜜蜂对大蜡螟幼虫和成虫的清理行为差异,探讨防治大蜡螟的新途径,本研究通过在蜂箱巢门口和蜂群内分别放置5龄大蜡螟幼虫、刚交尾的大蜡螟雌蛾和死亡雌蛾各30头(只),观察记录攻击大蜡螟的东、西方蜜蜂的数量、攻击时间及清理情况。结果显示:在蜂箱巢门口和巢内,参与攻击5龄大蜡螟幼虫和刚交尾的雌蛾的西方蜜蜂数量较东方蜜蜂多,攻击时间较长;西方蜜蜂会对死亡雌蛾进行清理,但东方蜜蜂不会;攻击结束后,西方蜜蜂会将遭攻击死亡的5龄大蜡螟幼虫和雌蛾拖离蜂箱,东方蜜蜂则放弃清理。表明西方蜜蜂对大蜡螟更敏感,清理能力更强。

大蜡螟作为试验昆虫资源的利用现状

随着对资源昆虫的不断认识,人们的目光开始逐渐转到对大蜡螟Galleria mellonella L.的开发利用方面,而不再仅仅局限于对它的防治方面。近些年来,大蜡螟逐渐被作为试验昆虫用于一些生物的研究。文章主要介绍大蜡螟被用于昆虫病原线虫、寄生蜂、新型隐球菌Cryptococcus neoformans、抗菌肽、抗菌免疫机制等方面的研究。

影响大蜡螟幼虫体色的环境因素初探

大蜡螟幼虫体色各式各样 ,通过对比实验分析了温度、湿度、密度、光照和食物等环境因素对大蜡螟幼虫体色的影响。实验结果表明 :不同温度、湿度、密度、光照条件下大蜡螟幼虫的体色均未变化。在研究食物对大蜡螟幼虫体色的影响实验中食蜂巢的白黄色幼虫身体内部发黑 ,这可能是黑色的蜂巢透射出的颜色。实验为进一步研究大蜡螟幼虫体色的遗传机制打下了基础。

大蜡螟幼虫消化道的组织学研究

通过组织解剖和石蜡切片的方法,在光学显微镜下观察了大蜡螟(Galleria mellonella)5龄幼虫消化道的组织结构,发现其消化道可分为前肠、中肠和后肠三部分,前肠和后肠肌肉层较中肠厚,整体结构与其它鳞翅目幼虫相似。其前肠由咽喉、食道、嗉囊、前胃和贲门瓣组成,其中前胃内膜特化出许多骨化的内膜齿突,贲门瓣为前肠和中肠的分界。中肠围食膜和内膜平滑且较薄,中肠肠壁细胞无论数量还是种类都比前肠和后肠多;中肠和后肠的交界处有1对幽门瓣,并着生有6条马氏管。后肠肌肉层次的排列与前肠相反,但结构却相似。

不同品系昆虫病原线虫对大蜡螟羧酸酯酶活性的影响

对不同品系昆虫病原线虫对大蜡螟(Galleria mellonella)5龄幼虫处理12 h的羧酸酯酶活性进行研究。结果表明:在供试的5种品系线虫中,NC34处理的大蜡螟-αNA羧酸酯酶活力最高,是CK的2.047倍;其次是Otio品系的处理,为CK的1.965倍。-βNA羧酸酯酶活性以Otio处理的酶活力最高。由此可见,不同品系昆虫病原线虫对大蜡螟羧酸酯酶活性的影响存在着明显差异。

拟双角斯氏线虫D43品系鞘蛋白对大蜡螟幼虫的免疫抑制作用

侵染期的拟双角斯氏线虫Steinernema ceratophorumD43品系体外都包裹着一个透明的体鞘。为探明体鞘对线虫侵染力的影响,了解鞘蛋白(sheath proteins,SPs)对大蜡螟Galleria mellonella幼虫的免疫抑制作用,本研究通过化学方法使拟双角斯氏线虫D43脱鞘,以对寄主的致死率和侵入点数量为指标,与包鞘线虫比较对大蜡螟幼虫的侵染力;采用乙醇提取的方法获得线虫鞘蛋白,利用双向电泳和质谱技术对鞘蛋白进行鉴定分析;从血细胞数量和酚氧化酶活力两个方面评价鞘蛋白对大蜡螟幼虫免疫反应的抑制作用。结果表明:0.5%次氯酸钠处理20min可以保证95%以上的线虫存活和脱鞘。与包鞘线虫相比,脱鞘线虫对大蜡螟幼虫的致死率显著降低,致死时间延后,节间膜侵入点数量显著减少。以35%乙醇提取的鞘蛋白提取物可鉴定出6种鞘蛋白,其中一个被鉴定为丝氨酸蛋白酶。此外,血腔注射鞘蛋白提取物可导致试虫血细胞数量明显降低,酚氧化酶活力受到显著抑制。由此说明,体鞘对拟双角斯氏线虫D43的侵染力具有显著影响,鞘蛋白在抑制寄主昆虫免疫反应中发挥重要作用。

蜡螟绒茧蜂对大蜡螟幼虫的寄生作用

以大蜡螟的低龄幼虫为寄主,在实验室条件下对蜡螟绒茧蜂的寄生作用进行了研究。结果表明:蜡螟绒茧蜂一生最多产卵68粒,平均45.85粒。蜡螟绒茧蜂卵产于寄主体内的位置多在1～4腹节;多数在寄主体内只产1粒或2粒卵。该蜂能寄生大蜡螟1～4龄幼虫,但2～4龄幼虫同时存在时,偏爱寄生2、3龄幼虫,其选择系数分别为0.35和0.42。