大规模并行焦磷酸测序技术简介

在后基因组时代,基因研究的焦点已经转移到每个人的基因组,因此迫切需要高通量的测序方法。近几年,出现了基于焦磷酸的新测序方法——大规模并行焦磷酸测序技术。在这项技术中,双链DNA首先被片段化,每单个寡核苷酸链分子结合到磁珠支持物上,用乳液PCR对结合的片段进行扩增。扩增后的片段-磁珠复合物被分别置于光纤芯片上的皮升级反应容器中。然后将DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷二磷酸酶等反应试剂加入到反应容器,经过聚合、硫酸化、氧化即可产生强度与结合的核苷酸数目线性相关的光信号,每个反应容器发出的光就能被探测到。利用这项技术在4.5h内可测序2000万～3000万碱基对,准确度达到99%或更高,并且无需在细菌体内进行亚克隆。大规模并行焦磷酸测序开启了个体化基因组学的新时代。

大规模并行基因组测序技术应用于无创产前诊断染色体非整倍体的研究

目的利用大规模并行基因组测序技术检测孕妇外周血浆中的游离DNA,行胎儿染色体非整倍体的无创产前诊断。方法选择2009年1月到2010年7月在深圳市人民医院产前诊断中心就诊,孕龄在8～30周之间高龄妊娠、唐氏综合征生化筛查高风险和(或)彩超显示胎儿异常等同意介入产前诊断的孕妇941例,抽取孕妇外周静脉血,提取血浆DNA,制备测序文库,应用Illumina HiSeq2000高通量基因测序仪检测,测得的基因序列与人类的参考基因组比对并作统计分析。同时采集胎儿羊水或脐血,经细胞培养后行羊水或脐血细胞染色体核型分析确定染色体非整倍体。结果①941例孕妇血浆样本处理后经大规模并行基因组测序技术检测判定胎儿为唐氏综合征高风险共27例,非唐氏综合征914例;以羊水或脐血染色体核型分析的结果为金标准进行结果对照,检测出的27例唐氏综合征高风险中2例误诊,其中一例核型为47,XXY,一例核型分析正常。经统计分析胎儿唐氏综合征的检出率为100%,检出正确率99.78%,误诊率0.22%;②941例样本中,检出18-三体高风险14例,18-三体低风险927例。与染色体核型分析相比,统计分析显示无创产前基因检测18-三体胎儿的检出率为93.33%(14/15),漏诊率为6.67%(1/15)、误诊率为0。结论利用大规模并行基因组测序技术检测孕妇外周血浆中的游离DNA行无创产前诊断胎儿染色体非整倍体,其敏感性、特异性与染色体核型分析技术具有较高的一致性。该技术具有无创性、高准确性、高通量等优势,具有临床实际应用价值。

大规模并行测序技术用于胎儿染色体非整倍体检测及羊水核型分析的探讨

目的应用羊水细胞染色体核型分析和基于大规模并行基因组测序的无创DNA检测技术检测孕妇外周血浆中的游离DNA，进行染色体异常的产前诊断。方法选择孕龄为15～29周的高龄妊娠、唐氏综合征筛查高风险、不良生育史和B超显示胎儿异常的孕妇176位，同时用两种方法进行检测。结果无创DNA检测共检出12例21三体（包括1例首次检测未见明显异常，第2次检测提示为21三体）和1例18三体，与羊水染色体核型分析结果符合率为100％。羊水染色体分析共发现异常核型24例，其中包括染色体数目异常ll例，染色体结构异常13例。结论基于大规模并行测序的无创胎儿DNA检测对于21三体和18三体有较高的敏感性和特异性，具有一定的临床应用价值。但羊水细胞染色体分析仍是安全、有效和最可靠的胎儿染色体病诊断方法。

无创性产前基因检测胎儿Turner综合征1例并文献复习

目的探讨胎儿Turner综合征的诊断方法。方法结合超声、大规模基因并行测序技术、染色体核型分析检测胎儿Turner综合征。结果测序技术的结果和染色体核型分析相符,显示胎儿核型为45,XO,引产后详细检查胎儿证实超声所见。结论运用母体外周血游离血浆DNA采用大规模基因并行测序技术产前检测胎儿染色体数目异常是可行的。

利用孕妇血浆中胎儿游离DNA进行无创伤性产前基因诊断的研究进展

孕妇血浆中胎儿游离DNA,源于胎儿细胞和/或胎盘的凋亡,经核酸内切酶选择性地剪切为313 bp以下的短片段分子,因相对含量丰富,成为了当前无创伤性产前分子遗传诊断中胎儿DNA的重要来源,业已开展了胎儿性别鉴定、RhD阴性孕妇的Rh(D)基因检测、胎儿非整倍体病的诊断、STR遗传标记检测等应用研究。根据胎儿游离DNA的浓度、纯度、分子片段大小分布的特征和检测的靶基因,采用相应的分子基因诊断策略和实验设计,限制扩增产物的片段长度,有助于提高无创伤性产前胎儿分子遗传诊断的成功率。当前,大规模并行基因组测序技术为直接利用胎儿游离DNA进行无创伤性产前基因诊断开辟了新途径。

应用母血中胎儿游离DNA进行无创产前诊断的研究进展

有创性产前诊断是诊断染色体病的金标准,但是不能广泛应用于所有孕妇;孕妇血中胎儿游离DNA的发现为无创性产前诊断提供了广阔前景,借助大规模并行基因组测序技术,建立起无创产前诊断染色体非整倍体的新方法。就胎儿游离DNA的来源、应用胎儿游离DNA进行非整倍体和基因产前诊断进行综述。

两例无创产前基因检测假阳性病例的分析

目的分析2例无创产前基因检测假阳性病例，为患者提供精确的染色体诊断结果。方法应用传统细胞核型分析、荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）及大规模并行基因组测序技术（massively parallel sequencing, MPS）对2例无创基因检测分别提示XO（＋＋＋）和T18（1／20）XO（＋）的胎儿进行检测分析。结果例1的无创基因检测结果提示为x0（＋＋＋），经羊水细胞传统核型分析、胎盘FISH检测及胎儿组织MPS检测后确诊为胎盘特异性嵌合的超雌综合征嵌合体，核型为47，XXX／46，XX。例2的无创产前基因检测结果提示为T18（1／20）XO（＋），经脐带血核型分析、MPS、FISH检测后确诊为特纳综合征，核型为45，X[48]／46，X，der（x）del（x）（p11．21）del（x）（q13．3）[62]。结论无创基因检测对于胎儿性染色体及18三体高危存在假阳性，提示在产前诊断中应合理联合应用各种不同的细胞分子遗传学技术进行分析。