大豆伴球蛋白组成亚基热稳定性及其相关影响因素分析

为了明确大豆伴球蛋白良好热稳定性的根源,以大豆伴球蛋白及其组成亚基为研究对象,从组分的角度分析探讨了表面疏水性和表面电荷对热稳定性的影响,探求热稳定性与表面性质之间的关系。实验结果表明,在低离子强度下,三种亚基都具有良好的热稳定性,粒度分布显示,β亚基生成的聚集体最大,达到100nm;在高离子强度下,三种亚基的粒度分布皆呈增大趋势,β亚基增幅最大,致使部分β亚基絮凝沉淀;大豆伴球蛋白亚基组分的热稳定性与表面疏水性及Zeta-电位有紧密的关系,通过直接控制三者的热聚集行为,从而影响体系的热稳定性。

异黄酮与β-伴大豆球蛋白的相互作用及其对蛋白结构和潜在致敏性的影响

探究异黄酮和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin,BCG)的相互作用机理及其对复合物结构和潜在致敏性的影响。利用荧光光谱、圆二色光谱分析2种大豆异黄酮(染料木素(genistein,Gen)、大豆苷元(daidzein,Dai))与BCG相互作用的猝灭类型、结合位点数、作用力类型和蛋白二级结构含量的变化,表征不同条件下制备的异黄酮-BCG复合物的结构,并利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)与消化产物免疫印迹检测其潜在致敏性。结果表明:活性异黄酮(Gen/Dai)对BCG的猝灭为静态猝灭,且相互作用力以疏水相互作用为主,结合位点数均接近1;并且与异黄酮相互作用诱导了BCG氨基酸微环境的极性增加,使蛋白肽链伸展,结构更为松散;ELISA与消化产物免疫印迹结果显示,与异黄酮结合后蛋白的潜在致敏性增强。本研究有助于科学认识异黄酮在食品复杂基质体系中对过敏蛋白致敏性影响机制,对其抗过敏的深度开发利用具有重要意义。

β-伴大豆球蛋白诱导杂交黄颡鱼肠道上皮细胞内质网应激模型的建立

实验旨在利用β-伴大豆球蛋白构建黄颡鱼上皮细胞内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。利用酶消化法分离得到黄颡鱼肠道上皮细胞,通过细胞形态、角蛋白18(Cytokeratin-18,CK-18)免疫荧光染色和碱性磷酸酶染色法鉴定。利用不同浓度β-伴大豆球蛋白刺激24h后,RT-qPCR检测相关基因转录表达水平,筛选最合适刺激浓度。在此浓度下分别刺激黄颡鱼肠道上皮细胞0、12h、24h和36h,使用RTqPCR、CCK8、透射电镜和免疫荧光染色等方法检测相关指标,筛选最适刺激时间。结果表明:(1)成功分离培养黄颡鱼肠道上皮细胞,细胞呈铺路石状,CK-18和碱性磷酸酶染色呈阳性;(2)成功筛选到4 mg/mLβ-伴大豆球蛋白为最佳刺激浓度。在该浓度下,除grp78、jnk、il-10、atf6外,内质网应激、自噬、凋亡、炎症等相关基因表达水平均显著最高(P<0.05);成功筛选24h为最适刺激时间。4 mg/mL β-伴大豆球蛋白刺激细胞24h显著降低细胞活力,同时引起内质网显著肿胀,GRP78、LC3、Caspase3蛋白表达和Tunel信号显著升高(P<0.01),perk、atf6、beclin1、lc3a、bcl2、caspase3、caspase9和il-12 mRNA表达水平显著最高(P<0.05)。综上,实验成功分离得到黄颡鱼肠道上皮细胞,构建了黄颡鱼肠道上皮细胞内质网应激模型。实验为进一步研究未折叠反应信号通路在黄颡鱼豆粕诱导肠炎发生发展中的作用奠定基础。

透明质酸-大豆β-伴球蛋白复合膜对鲢鱼片微冻贮藏品质影响

为解决淡水鱼在贮藏过程中蛋白质氧化及品质劣变问题,采用0.9%透明质酸(hyaluronic acid,HA)分别与1%、2%、3%大豆β-伴球蛋白制备复合涂膜剂处理鲢鱼肉,在-3℃微冻贮藏28 d,考察鲢鱼肉贮藏期的持水力、色差(△E)、pH值、电导率、挥发性盐基氮(total volatile basicnitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric reactive subs-tances,TBARS)、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性肽含量的变化,探究鱼肉肌原纤维蛋白氧化规律,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)研究涂膜及微冻技术对鲢鱼肉蛋白质氧化及品质的控制作用。结果表明:与未经涂膜鲢鱼肉相比,复合涂膜可以延缓鲢鱼肉TVB-N、TBARS、pH值、电导率、TCA可溶性肽含量的升高,抑制鱼肉持水力、△E的下降。经复合涂膜处理,鱼肉肌原纤维蛋白巯基含量及钙离子ATP酶(calcium-ATPase,Ca^(2+)-ATPase)的活性提高,羰基含量和表面疏水性明显降低。主成分分析提取的2个主成分的累计方差贡献率达到86.782%,能较好地反映原始信息,可直观了解到各涂膜处理鲢鱼肉品质变化趋势。综合评定,0.9%HA-2%大豆β-伴球蛋白涂膜鱼肉的保鲜效果最佳。

糖基化β-伴大豆球蛋白负载提高姜黄素抗氧化及缓释特性

利用干法糖基化制备β-伴大豆球蛋白(soyβ-conglycinin,7S)-葡聚糖共价接枝物包埋姜黄素,并研究姜黄素的抗氧化及缓释效果。结果表明,随着反应时间(0、24、48、72 h)延长,7S-葡聚糖共价复合物接枝度和褐变度逐渐增加,至72 h达到最高,分别为15.02%和0.24。通过pH值循环法诱导7S、7S-葡聚糖封装姜黄素,形成7S-姜黄素、7S-葡聚糖-姜黄素纳米复合物,发现反应时间为72 h时,7S-葡聚糖表现出最高的姜黄素负载量(129.61μg/mg),显著高于7S(69.06μg/mg)。荧光光谱分析表明姜黄素主要通过疏水相互作用与7S、7S-葡聚糖-72 h结合。透射电子显微镜观察到7S-姜黄素和7S-葡聚糖-72 h-姜黄素纳米复合物为球形。姜黄素质量浓度为100μg/mL时,与游离的姜黄素相比,封装在7S-葡聚糖-72 h内的姜黄素抗氧化能力提高1.36倍,且表现出稳定的缓释性能。7S-葡聚糖-72 h负载的姜黄素生物可利用率为66.83%,而7S负载的姜黄素和游离姜黄素生物可利用率分别为48.93%和33.06%。研究结果表明7S-葡聚糖-72 h可作为良好的姜黄素纳米载体,改善其抗氧化及缓释能力。

大豆7S球蛋白β-伴大豆球蛋白的研究现状

大豆β-伴大豆球蛋白约占大豆籽粒总蛋白含量的25%,是7S球蛋白的组分之一,是影响大豆籽粒蛋白营养品质及加工品质的重要组分。本文对大豆7S球蛋白β-伴大豆球蛋白的基本属性,亚基积累规律,遗传变异体的种类及其分子遗传学水平的研究现状等进行了综述。

植物乳酸菌发酵对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白免疫活性及水解度的影响

本试验通过植物乳酸菌对豆粉进行液态发酵,在发酵24,36,48,60,72 h时采集发酵样品进行水解度和免疫活性的检测,结果表明:(1)48 h为植物乳酸菌发酵豆粉的最佳时间,可去除71.08%的β-伴大豆球蛋白和64.22%的大豆球蛋白的免疫活性(P<0.01),对β-伴大豆球蛋白的去除程度显著高于大豆球蛋白(P<0.01)。(2)乳酸菌发酵可显著提高豆粉中蛋白质的含量、水解度(P<0.01)以及体外消化率(P<0.01)。(3)蛋白质的水解度与大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白免疫活性之间存在强烈的负相关(P<0.01),与蛋白质的体外消化率存在正相关(P<0.01)。

β-伴大豆球蛋白β亚基的纯化及免疫活性鉴定

等电点沉淀法和凝胶过滤层析提纯的β-伴大豆球蛋白经6mol·L-1脲变性后解聚为游离亚基,利用DEAE琼脂糖凝胶FF离子交换层析分离纯化β-伴大豆球蛋白亚基,并对纯化亚基进行透析复性。同时将β-伴大豆球蛋白免疫家兔制备抗血清,利用免疫印迹方法检测纯化的亚基与β-伴大豆球蛋白抗血清是否发生免疫反应。结果表明:利用DEAE琼脂糖凝胶FF阴离子交换层析可以纯化出高纯度的β-伴大豆球蛋白β亚基,纯化的β亚基可以与抗β-伴大豆球蛋白抗体结合,具有免疫活性。

蒸汽处理前后β-伴大豆球蛋白在仔猪消化道内免疫活性变化规律的研究

随机从2窝“杜长约”三元杂交仔猪中挑选12头,分成A、B、C3组,每组4个重复,公、母各半。21日龄断奶;22-26日龄,A组饲喂不舍任何豆科植物的代乳料,B、C组分别饲喂合纯化的蒸汽处理前、后β-伴大豆球蛋白的代乳料。26日龄全部屠宰,取胃、空肠中段、盲肠和结肠中的食糜,以测定消化道各部位β-伴大豆球蛋白的免疫活性。结果表明:随着消化道的延续,β-伴大豆球蛋白的免疫活性均呈下降趋势;与消化道其他部位比较起来,活性在胃和空肠下降幅度较大,到空肠中段基本丧失,从空肠中段到结肠无明显变化;整个消化道中,采食含未经蒸汽处理β-伴大豆球蛋白代乳料仔猪中β-伴大豆球蛋白免疫活性的下降幅度均小于采食含蒸汽处理β-伴大豆球蛋白代乳料的仔猪。

伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽对小鼠免疫功能及肠道内环境的影响

90只清洁级昆明系小鼠,随机分为5组,预饲基础日粮一周后,各组分别灌胃:生理盐水(对照组,CK)、伴大豆球蛋白液(Ⅰ)、伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解液(Ⅱ)、伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解液提纯B组分(Ⅲ)、伴大豆球蛋白盐酸水解液(Ⅳ),除对照组外,各处理组灌胃液体总含氮量相等,实验期21d。结果显示:与对照组相比,第3周Ⅱ组和Ⅲ组每只小鼠日均采食量较对照组显著下降,分别降低8.75%(P<0.05)和9.28%(P<0.05);Ⅲ组小鼠胸腺相对质量极显著下降,降低了10.40%(P<0.01),肠黏膜sIgA水平提高45.49%(P<0.01),大肠食糜中6磷酸果糖酮糖酶(F6PPK)活性极显著提高(P<0.01),pH值下降了1.80%(P<0.05),肠球菌数显著下降(P<0.05)。实验结果表明水解肽作为腔内信号分子可能与肠道内相关因素有着多层次调控关系,共同促进宿主的健康。

2种黑豆球蛋白与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相互作用研究

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)在不同pH值环境中的主要存在形式不同,其抗氧化能力也有所差异。黑豆蛋白是一种常见的膳食蛋白,具有作为不稳定生物活性化合物载体的潜力,了解黑豆球蛋白与C3G的相互作用机制有利于它们在食品体系中的应用。通过多种光谱学分析和分子对接实验研究了pH值为2.0、5.0和7.0时黑豆β-伴大豆球蛋白(7S)和大豆球蛋白(11S)与C3G的相互作用及其对C3G氧化稳定性和抗氧化能力的影响。研究结果表明,pH值为2.0和5.0时,C3G与7S和11S结合不仅导致Tyr残基周围的疏水环境减少,极性增加,而且使7S和11S中α-螺旋增加,β-折叠比例下降。pH值为7.0时,C3G的存在使7S和11S中α-螺旋和β-折叠的占比呈增加趋势,但β-转角比例降低。此外,C3G与7S和11S结合是一个放热过程,在不同pH值条件下,C3G与7S和11S主要通过氢键和范德华力相互作用使7S和11S静态荧光猝灭。7S和11S均在pH值为7.0时对C3G亲和力最强。分子对接结果表明,7S上的GLU229、ARG356和PRO101残基,11S上的ARG161、VAL162、ILE171和THR176残基在与C3G结合中起关键作用。在不同pH值条件下,7S、11S与C3G结合后均显著增强了C3G的氧化稳定性和抗氧化能力。

大豆β-伴大豆球蛋白研究进展

在大豆抗原蛋白的研究中,β-伴大豆球蛋白的研究比较重要。在其结构和特性方面,β-伴大豆球蛋白的α′亚基和该亚基上的Soymetide研究较为深入,并且摄入β-伴大豆球蛋白与体内甘油三酯含量有一定关系。很多研究表明,仔猪腹泻、犊牛腹泻的主要诱因来自于抗原性蛋白所引起的体内消化道免疫反应。不同的加工工艺如挤压膨化、乙醇浸提,可以降低β-伴大豆球蛋白对于机体的损害,本文还基于现在的研究提出了进一步的展望。

分离β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白工艺研究

采用大容量(250×4mL)低速(5300×g)离心机分离β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白,进行碱溶条件、酸沉条件等条件的研究。结果表明:提取蛋白的碱性溶液(pH8.5的Tris-HCl溶液)离心效果较佳,沉淀大豆球蛋白pH6.4为佳,沉淀β-伴大豆球蛋白pH4.8为佳,用pH5.0沉淀杂蛋白离心分离效果较好;每一个待离心的浊液,在离心之前4℃冷藏2h以上,对离心效果的提高十分有效;采用最佳条件,从300g脱脂豆片分离大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白,收率分别为6.8%和2.2%,用SDS-PAGE电泳实验方法测定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白样品纯度分别为89.1%和78.9%。因此该低速离心法较适合数十克级别的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的分离。

伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽对双歧杆菌增殖的影响

大豆种子的贮藏蛋白主要由2种球蛋白组成,伴大豆球蛋白(conglycinin)是其中一种,它由3个不同的亚基组成。文中对伴大豆球蛋白进行了分离纯化,并研究了其体外经过胃蛋白酶水解后的肽对双歧杆菌增殖的影响。结果表明,分离纯化的伴大豆球蛋白纯度为90.13％,可供生理功能的研究,经胃蛋白酶水解后的肽能够促进双歧杆菌的增殖,表现出一定的生物活性作用。

伴大豆球蛋白水解肽对灌喂大肠杆菌(E.coli)的小鼠肠道微生物区系和健康的影响

目的研究服用伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽的小鼠,灌喂E.coli后的健康状况,分析小鼠灌喂E.coli后24h,48h粪样微生物区系的变化。方法应用PCR-DGGE技术对小鼠粪样微生物区系进行相似性分析;应用连续稀释PCR的方法检测小鼠灌喂E.coli后24h,48h粪样中细菌的数量;同时观察小鼠灌喂E.coli后的健康状况。结果小鼠灌喂E.coli后24h,盐酸彻底水解伴大豆球蛋白液组(HCL-FHC)和灌菌对照组(CON)的相似性较高(71.5%),伴大豆球蛋白组(Conglycinin)和伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽组(PTC)与正常对照组(CONN)的相似性都较高(分别为82.4%和72.9%);灌喂E.coli后48h,CONN组和CON组的相似性不高(59.6%),PTC组和CONN组的相似性较高(73.7%),PTC组和Conglycinin组、HCL-FHC组、CON组的相似性都不高(分别为51.4%、56.3%、48.1%),PTC组小鼠粪中细菌的数量明显低于CON组和HCL-FHC组,同时PTC组健康小鼠的数量明显多于其它处理组。结论伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解肽能维持肠道健康的微生物区系,降低肠道细菌的数量,维持感染E.coli后小鼠的健康。

β-伴大豆球蛋白α′-亚基的基因克隆及原核表达

为制备N-连接糖基缺失的重组β-伴大豆球蛋白α′-亚基,以‘鲁96150’大豆种子为原料提取总RNA,经RT-PCR一步法获得‘鲁96150’大豆的全长cDNA,采用自行设计的引物F1/F2扩增得到目的基因α′,与pGEM-T easy载体相连构建重组克隆载体pGEM-α′,经XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切得到目的基因与载体pET-28a连接构建重组原核表达载体pET-28a-α′,将经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确的表达载体转入感受态细胞E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白α′-亚基。对重组α′-亚基的诱导表达条件进行筛选,发现在菌液OD600值为0.8、诱导温度30℃、IPTG浓度为0.2mmol/L的诱导条件下诱导9h后α′-亚基的表达量较高,重组α′-亚基的分子质量大小约为70ku;工程菌pET-28a-α′-BL21经超声破碎、离心后发现重组α′-亚基部分存在于上清液中,部分形成包涵体蛋白。重组α′-亚基的克隆及表达为β-伴大豆球蛋白结构及功能特性的研究奠定基础。

透明质酸-大豆β-伴球蛋白涂膜对微冻鲤鱼的保鲜效果

目的研究不同比例透明质酸和大豆β-伴球蛋白复合膜处理对鲤鱼肉微冻贮藏品质的影响。方法用浓度为0.9%的透明质酸(hyaluronic acid,HA)分别和1%、2%、3%大豆β-伴球蛋白配制3种涂膜剂,涂膜分割鲤鱼肉后进行‒3℃微冻贮藏,测定鲤鱼肉持水力、电导率、pH、色度、挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric reactive substances,TBARS)值、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)可溶性肽以及肌原纤维蛋白、表面疏水性、羰基、巯基和钙离子ATP酶(calcium-ATPase,Ca^(2+)-ATPase)活性的变化。结果未涂膜鲤鱼肉在微冻贮藏14 d后品质显著下降,HA-大豆β-伴球蛋白复合膜可有效抑制微冻鲤鱼肉持水力、肌原纤维蛋白、巯基和Ca^(2+)-ATPase活性的下降(P<0.05),延缓TVB-N、TBARS、TCA可溶性肽、电导率和羰基的增长速率(P<0.05)。0.9%HA-2%大豆β-伴球蛋白复合膜保鲜28 d时,较未涂膜鲤鱼肉电导率、TVB-N、TBARS和TCA可溶性肽分别降低20.2%、48.9%、62.6%和20.7%;肌原纤维蛋白含量和持水力分别高40.6%、27.9%。结论0.9%HA-2%大豆β-伴球蛋白复合膜保鲜效果最好,该复合涂膜剂可有效延缓微冻鲤鱼肉的品质劣变,延长货架期。

伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征

研究了色谱方法对伴大豆球蛋白组成3个亚基的分离纯化工艺条件,并利用圆二色光谱对纯化得到的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。结果显示:利用离子交换色谱(DEAE-sepharose fast flow,DEAE为二乙氨乙基)和金属螯合层析(Immobilized metal affinity column,IMAC)相结合的方法,能将3个亚基组分完全分开,得到了能制备相对大量的3个亚基α′,α和β的稳定工艺,纯度为95%,回收率达75%。远紫外CD结果显示,在3个亚基的二级结构中,α螺旋较少,但都具有较高含量的β折叠和无规卷曲;近紫外CD结果显示,3个亚基在制备过程中因为尿素的变性作用,都已经散失了三级结构。

伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解产物中促双歧杆菌增殖肽的分离和鉴定

大豆贮藏蛋白主要包括大豆球蛋白(Glycinin)和伴大豆球蛋白(Conglycinin),本研究采用Sephadex-G15凝胶过滤和薄层层析的方法,对伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解产物中促双歧杆菌增殖肽进行分离,所得活性组分通过毛细管HPLC及质谱进行鉴定,结果表明,分离得到促双歧杆菌增殖活性最强的组分是由性质相近的肽混合物组成,通过毛细管HPLC可以得到活性酶解肽的图谱,并通过质谱可知酶解肽主要由6-10个氨基酸残基组成。上述结果提示,伴大豆球蛋白中的生物活性物质是以无活性的形式存在于蛋白质的多肽链中,必须通过适当酶解,在一定条件下才能释放出来,发挥出各种生物学功能。

大豆皮中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和凝集素免疫活性的检测

由于大豆皮具有多种有益的功能,因而被添加于多种动物的饲料中。国内外学者对大豆皮的研究主要集中在大豆皮的可消化性和能量价值,而对大豆皮中抗营养因子组成及含量的研究报告非常的少。本文用竞争ELISA法对大豆皮中具有免疫活性大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和凝集素的含量进行了测定,结果显示生大豆皮中具有免疫活性的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和凝集素的含量分别为25.3、41.4和12.2mgg-1,说明大豆皮中含有相当高水平的抗营养因子。因此,大豆皮添加到动物饲料中之前,必须经过适当的加工处理,以在最大程度上灭活其中具有免疫活性的抗营养因子,且应该注意添加量等问题。