大豆磷脂酶D的固定化及其催化功能

目的:单因素试验研究大豆磷脂酶D(phospholipase D,PLD)的固定化工艺以及固定化PLD催化合成大豆磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的最佳工艺。方法:首先通过非极性溶剂辅助Stober法制备纳米级介孔二氧化硅作为固定化酶的载体,通过吸附-沉淀-交联方式将PLD固定,单因素试验优化固定化条件,并对固定化后的PLD进行结构表征和热稳定性及贮存稳定性研究;然后利用固定化PLD以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物催化合成PS,并通过单因素试验确定最佳合成工艺;最后对固定化PLD的循环使用性能进行研究。结果:非极性溶剂辅助Stober法制备的介孔二氧化硅BET比表面积为948 m^(2)/g,气孔体积为1.35 cm^(3)/g,孔径为8.20 nm,平均粒径为335.10 nm,扫描电镜确定载体的形貌为近球形结构;当加入5.00 mL乙醇、1.00 mL酶液(温度为35℃、pH为6.50)、0.40 mL戊二醛时,固定化PLD的相对酶活达到最大值(88.39%±1.00%),蛋白固定化率为80.76%±1.30%;70℃时游离PLD的相对酶活剩余15.30%,而固定化PLD的相对酶活仍然有66.40%,且游离PLD被固定化后半衰期由20 d延长到50 d;当乙酸乙酯与乙酸钠/醋酸缓冲溶液的比为6∶1,卵磷脂与L-丝氨酸的质量比为1∶8,反应温度为40℃,pH为6.50,固定化PLD的加入量为40%,反应时间为12 h时,PS的产率达86.60%±1.40%,纯度为90.30%,且固定化PLD循环使用7次PS的产率仍有61.70%±1.60%,而游离PLD循环使用4次PS的产率只剩余21.60%±1.80%。结论:介孔二氧化硅固定化PLD的稳定性、催化性能均显著提高,实现了PLD的回收重复使用,降低了生产成本;同时为PS的固定化酶法工业化生产提供技术支持。