大赖草6-SFT基因的克隆及其转基因烟草抗旱和抗寒性分析

果聚糖合成酶(6-SFT)在植物抵御逆境胁迫中起重要作用。利用RACE结合RT-PCR技术从大赖草(Leymus racemosus,2n=4x=28,NsNsXmXm)中克隆到6-SFT基因,其完整开放阅读框为1863 bp。该基因被命名为Lr-6-SFT(GenBank登录号KT387273),编码620个氨基酸,其推导氨基酸序列含有保守的果糖基转移酶结构域。氨基酸序列比对及进化树分析表明,大赖草6-SFT与华山新麦草、普通小麦、西尔斯山羊草和大麦6-SFT具有高度相似性。采用基因重组技术构建p1300-35SN-Lr-6-SFT表达载体,利用农杆菌介导法将该载体转入烟草品种W38中。对经过抗性筛选、PCR和RT-PCR验证的转基因植株进行抗旱和抗寒性鉴定,发现转基因植株与对照相比,抗旱和抗寒性明显增强;在逆境胁迫条件下,转基因植株的果聚糖、可溶性糖、脯氨酸含量都显著高于对照,而丙二醛的含量显著低于对照。本研究表明,Lr-6-SFT基因是典型的GH32家族成员,其表达能够提高烟草对干旱和寒冷胁迫的抗性。

小麦-大赖草易位系的RFLP分析

利用辐射、花药培养及杀配子基因效应已创制出一系列小麦 -大赖草易位系。为在其中找出可能的纯合易位系、明确易位所涉及的相关染色体以及易位断裂点的确切位置 ,利用了已被定位于小麦 7个部分同源群染色体长、短两臂上的 67个探针进行了RFLP分析 ,结果鉴定出 3个纯合的易位系 :T1BL·7Lr#1S、T4BS·4BL - 7Lr#1S和T6AL·7Lr#1S。其中 ,易位系T1BL·7Lr #1S和T6AL·7Lr #1S中染色体 7Lr #1的断裂点位于标记MWG80 8和标记ABG476.1之间 ,而 1B和 6A染色体上的断裂点都在着丝粒附近。易位系T4BS·4BL - 7Lr#1S中染色体 7L #1的断裂点位于标记BCD349和标记CDO5 95之间 ,4B染色体断裂点则位于标记CDO5 4 1和标记PSR1 64之间的长臂上。

大赖草DNA导入小麦获得大穗品系的农艺性状和贮藏蛋白研究

应用花粉管通道法将大赖草 DNA导入小麦 ,已从受体 761转化后代中选育出稳定遗传的大穗变异系。主要特征为 :( 1 )大穗变异系生育期晚 ,株型高大 ,叶片宽大 ,穗长、穗粒数和单株粒重显著增加 ,同时籽粒长、宽和千粒重明显提高 ;( 2 )大穗变异系除蛋白质含量有显著变化外 ,其胚乳谷蛋白和醇溶蛋白电泳图谱发生了明显变化 ,出现了新的蛋白组分和受体一些带的消失。由此可见 ,大赖草 DNA导入小麦后发生广泛变异 ,可能是外源

小麦-大赖草易位系对赤霉病抗性的聚合

利用C-分带、FISH、SSR技术，从小麦-大赖草易位系T01～T14中筛选出8个纯合易位系。将不同易位系相互进行杂交，配制了11个杂交组合，并对各易位系及其杂种后代进行赤霉病抗性鉴定。结果表明，大赖草各易位系对赤霉病的抗性接近于苏麦3号，但不同地点及年份间差异较大。涉及不同大赖草染色体的易位系间的杂种F1与其抗性较高的易位系亲本相比抗性有所提高，但涉及大赖草Lr．7或5Lr#1同一条染色体的不同易住系间杂种F1的抗性仅位于两亲本之间。这表明位于不同大赖草染色体上的抗赤霉病基因具有累加效应，通过不同大赖草染色体易位系的聚合，可提高赤霉病的抗性。

将大赖草种质转移给普通小麦的研究──Ⅲ．抗赤霉病异附加系选育

大赖草比抗病品种“苏麦３号”更抗小麦赤霉病。经离体和活体赤霉病抗性单花滴注鉴定和有丝分裂中期及减数分裂中期Ⅰ的Ｃ－分带分析，选育出添加了１对第２染色体的抗赤霉病异附加系，其４４条染色体在ＭＩ配成０．１２—０．４０ⅠＩ＋２１．７０—２１．９３Ⅱ＋０．０１—０．０４Ⅳ。经Ｃ－分带和生物素标记的染色体组ＤＮＡ作探针的分子原位杂交分析证实添加的１对外源染色体在ＭＩ配成二价体，在细胞学上已基本稳定。

大赖草总DNA转化小麦的分子证据

用来自大麦基因组的4个高度重复序列克隆了pHv7161、pHv7179、pHv7191和pHv7293，经地高辛和同位素2种方法标记后作为探针，对新疆大赖草（供体）、春麦761（受体）以及用大赖草总DNA通过花粉管通道转化成功的大穗转化株基因组在高度严谨条件下进行了分子杂交。结果表明，这4个探针可以探查出基因组内一种具有主串联重复单位的散在重复序列。比较受体、供体和转化株的杂交图谱，发现在转化株中出现了受体没有而供体具有的带。把上述经pHv7179探针探查出的在供体（大赖草）和转化株中共有的HindⅢ片段进行克隆，将大赖草片段克隆命名为pLR980。经与上述4种大麦重复序列杂交证明pLR980包含了4种大麦重复序列的同源序列。用大赖草DNA克隆pLR980对供体大赖草、受体春麦761和转化株大穗小麦的基因组进行了分子杂交，结果表明pLR980在大赖草和小麦的基因组间是同源的，并且再次探查出了供体大赖草与转化株大穗小麦共有而受体没有的带。说明pLR980为大赖草总DNA通过花粉管通道法转化小麦的相关DNA片段。这为总DNA导入提供了直接的分子证据。这个转化片段已经过分离克隆，可用于进一步的研究。

大赖草的组织培养及植株再生的研究

大赖草的成熟胚在含有２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ的ＭＳ培养基上形成颗粒状愈伤组织。减少培养基中的２，４－Ｄ浓度，愈伤组织分化出绿色的芽点。生根培养基为不含任何激素的ＭＳ培养基。有分化能力的愈伤组织可以在保持培养基（ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡＰ）上长期保存。利用这一培养程序可以快速，大量地繁殖大赖草。文章还对外源激素在植物组织培养中的作用进行了讨论。

普通小麦–大赖草易位系T7BS·7Lr#1S和T2AS·2AL-7Lr#1S的分子细胞遗传学鉴定

大赖草7Lr#1S染色体上携带赤霉病抗性基因,将其导入普通小麦有助于增加赤霉病抗源多样性和选育抗赤霉病品种。利用染色体C-分带、荧光原位杂交和分子标记技术从普通小麦–大赖草7Lr#1单体异附加系的花粉辐射后代中,选育出易位系T7BS·7Lr#1S(NAU639)和T2AS·2AL-7Lr#1S(NAU640)。经连续3年大田、温室赤霉病接种鉴定,这2个易位系的赤霉病抗性均显著高于感病亲本中国春、感病对照绵阳8545和石麦4185,为赤霉病抗病育种提供了新的种质资源。

8个大赖草材料的C-分带和RAPD分析

利用C-分带和RAPD对小麦族赖草属的8个材料进行了比较研究。结果发现,大部分染色体都显示较强的末端带,着丝粒带和中间带则不丰富,除02I-191号材料外,其他几种材料之间变异不大。RAPD结果表明,45条随机引物中的35条(占77.8%)扩增出131条具有多态性的条带,其中22条为特异性条带,可以分别追踪8个大赖草材料。另外,OPC05还可以特异性追踪大赖草添加系中的第7和第14号染色体。

大赖草及近缘种染色体C-分带的研究

对Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍｎｂｅｓａｒａｂｉｃｕｍ（Ｓａｖｕｌ．＆Ｒａｙｓ）Ａ．Ｌｖｅ、新麦草（Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓｊｕｎｃｅａ（Ｆｉｓｃｈ．）Ｎｅｖｓｋｉ）和大赖草（Ｌｅｙｍｕｓｒａｃｅｍｏｓｕｓ（Ｌａｍ．）Ｔｚｖｅｌ．）染色体Ｃ分带的核型进行了比较研究。Ｔｈ．ｂｅｓａｒａｂｉｃｕｍ和新麦草的染色体在Ｃ分带带型上有明显的差异，显示了物种的特异性。３个物种的核型表明，Ｃ带带纹主要分布在染色体的末端，大部分染色体不显着丝粒带和中间带。在大赖草染色体上的末端带很明显。一些大赖草的染色体具有与Ｔｈ．ｂｅｓａｒａｂｉｃｕｍ和新麦草某些染色体相似的Ｃ带带型。对大赖草染色体组与Ｔｈ．ｂｅｓａｒａｂｉｃｕｍ和新麦草染色体组的关系进行了讨论。

一个普通小麦-大赖草易位系T01的选育与鉴定

将抗赤霉病的普通小麦 -大赖草 Lr.2染色体单体异附加系花粉经过 60 Co- γ射线处理 ,然后给感赤霉病的普通小麦品种“扬麦 5号”授粉 ,杂交后代连续 2年进行赤霉病抗性单株接种鉴定 ,从中选育出一个普通小麦 -大赖草异易位系。经过染色体荧光原位杂交和 Giemsa C-分带鉴定 ,易位发生在普通小麦 4 B染色体长臂和大赖草第 2条染色体 ( Lr.2 )的短臂之间 ,易位断点在 4 B染色体 C-带带型的 L 2 .2区 ,在 FL0 .4 2和 FL0 .61二条带纹之间 ,为 T4 BS.4 BL- L r.2 S易位染色体 ,含该易位染色体的个体称为 T0

普通小麦-大赖草易位系NAU601和NAU618的选育及双端二体测交分析

利用根尖体细胞有丝分裂中期染色体GiemsaC 分带和荧光原位杂交从普通小麦 大赖草Lr.2、Lr.7异附加系辐射后代中选育出 2个纯合易位系 :(1)易位系NAU6 18(MS14 2 3) ,2n =4 4 ,易位染色体由大赖草Lr.7染色体的大部分 (约 5 / 6 ,包括着丝粒 )及小麦染色体 1A短臂的一部分 (近端约 1/ 3)组成 ,外源染色体片段的长度约占易位染色体总长度的 4 / 5 ;(2 )易位系NAU6 0 1(MS10 1 4 ) ,2n =4 2 ,易位染色体由小麦染色体 4B的整个短臂和 4B长臂近着丝粒部分 (1/ 3)及大赖草Lr.2短臂的绝大部分组成 ,外源染色体片段占易位染色体长臂的 1/ 2。对易位系进行的双端二体测交分析证实易位所涉及的小麦染色体分别为 1A和 4B。连续 3年单花滴注法进行的田间赤霉病抗性接种鉴定结果表明 ,普通小麦 大赖草异源易位系NAU6 18(MS14 2 3)对赤霉病的抗性与抗病对照品种苏麦 3号相仿 ,易位系NAU6 0 1(MS10 1 4 )对赤霉病抗性低于苏麦 3号 。

利用花粉辐射诱发普通小麦与大赖草染色体易位的研究

将小麦－大赖草Ｌｒ．２和Ｌｒ．１４染色体二体异附加系 ９４Ｇ１５和 ９４Ｇ４５即将成熟花粉经(６０)Ｃｏ－γ射线辐射处理，然后分别给普通小麦品种扬麦 ５号和绵阳１１授粉。辐射 Ｍ１的 ＰＭＣ ＭＩ期染色体经 Ｃｈｅｍｓａ Ｃ－分带和基因组ＤＮＡ荧光原位杂交处理后进行染色体配对分析，从 １７株 ＭＩ单株中筛选到５株ＰＭＣ ＭＩ期大赖草染色体与小麦配对的个体。根据这５株单株自交Ｍ１种子根尖细胞有丝分裂中期染色体Ｃ－分带和原位杂交检测，筛选并鉴定出了ＬＷ８（３）１和ＬＷ１１（３）１２个涉及大赖草Ｌｒ．１４染色体的小麦－大赖草易位系。还就花粉辐射在诱发小麦－亲缘物种染色体易位的可行性及有效性，以及所获２个易位系的利用价值进行了讨论。

将大赖草种转移给普通小麦的研究Ⅵ.端体异附加系的选育与鉴定

利用根尖细胞有丝分裂中期染色体计数、花粉母细胞减数分裂中期Ｉ（ＰＭＣＭＩ）染色体构型分析以及Ｃ－分带，从普通小麦中国春与大赖草（ＬｅｙｍｕｓｒａｃｅｍｏｓｕｓＬａｍ．）杂种回交后代中，选育出两个端二体异附加系９５Ｇ０９．９５Ｇ１１和一个添加了一时大赖草第１４号染色体和另一对端体的双重异附加系９５Ｇ３０２（２ｎ＝４４＋２ｔ），它们的ＰＭＣＭＩ染色体配对构型分别为０．２１个单价体（其中０．１６个端体单价体）、１９．５７个环状二价体＋２．３２个棒状二价体（其中０．９２个由两端体配对构成），１．５２个单价体（１．４４个端体单价体）＋１８．０７个环状二价体＋３．１７个棒状二价体（０．２８个由两端体配对构成），１．０３个单价体（０．７２个端体单价体）＋１８．８９个环状二价体＋３．６１个棒状二价体（０．６４个由两端体配对构成）。运用单花滴注技术对这些材料在活体和离体条件下进行赤霉病人工接种鉴定，结果表明：９５Ｇ３０２的抗性与抗赤霉病对照品种苏麦３号相仿；９５Ｇ１１的抗性高于苏麦３号，明显高于亲本品种中国春。还对端体附加系的利用以及有效、快捷地转移赤霉病抗性基因进行了讨论。

导入大赖草DNA小麦后代的变异性状分析

外源大赖草DNA直接导入普通小麦,诱导小麦籽粒蛋白质组成及过氧化物酶、酯酶、超氧化物歧化酶同工酶谱带发生了显著变化,蛋白质分别增加44,67,85ku新组分,蛋白质和氨基酸含量分别提高16.82%,15.62%,赖氨酸增长42.94%,同工酶不同程度出现了差异谱带,酶带缺失,酶活性增减的明显变化。导入DNA的变异小麦的籽粒色泽、硬度、胚乳粉质等生物学性状都有一些改变,其变异现象在连续后代中依然表达。

新疆大赖草DNA导入小麦后代种子醇溶蛋白的分析

通过花粉管导入法将新疆大赖草（Ｌｅｙｍｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ（Ｌａｍ．）Ｔｚｖｅｌ）供体ＤＮＡ导入春小麦７６１（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）受体的胚囊中，获得了大穗及密穗两大类遗传变异后代。经用改进的酸性聚丙烯酸胺凝胶电脉法（Ａ－ＰＡＧＥ），分析了１０个株系样品的种子醇溶蛋白，图谱结果显示５个大穗变异株系样品之间表现为同样带型，均与受体有显著差异，表现为某些带的消失与增加，而且增加带与供体的电泳条带位置相同；４个密穗变异株系样品和受体相比有两种带型，表现为带的减少与浅带的加深。这些均表明大救草ＤＮＡ以花粉管为通道导入小麦，转化株系后代中发生了基因水平的变异。

利用减数分裂期成株电离辐射选育小麦-大赖草易位系的研究

采用６００１１２５Ｒ剂量的６０Ｃｏγ射线对小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）大赖草（Ｌｅｙｍｕｓｒａｃｅｍｏｓｕｓ（Ｌａｍ．）Ｔｚｖｅｌ．）Ｌｒ．７单体异附加系在减数分裂期进行成株辐射处理，经过Ｍ１代根尖细胞有丝分裂中期（ＲＴＣ，Ｍ期）染色体ＧｉｅｍｓａＣ分带粗筛，Ｍ２代ＲＴＣＭ期染色体Ｃ分带和荧光原位杂交鉴定，选育出２个小麦大赖草Ｌｒ．７异易位系。其中Ｔ０２易位系是由Ｌｒ．７染色体绝大部分与一小片段小麦染色体接在一起组成的易位类型（ＴＬｒ．７·Ｌｒ．７Ｗ）；Ｔ０８的易位染色体由小麦４ＡＬ和大赖草Ｌｒ．７某臂组成。

新疆大赖草幼胚花药培养及植株再生

以 C1 7为基本培养基分别添加 2 ,4D、Dicamba和 PAA三种等激素对大赖草的幼胚进行了离体培养 ,试验表明 ,部分幼胚可在原培养基中依次完成愈伤组织的诱导、分化及植株再生 ,2 ,4D和 Dicamba对大赖草幼胚愈伤组织诱导效果好 ,PAA对一步成苗有良好的促进作用。C1 7和 W1 4 两种培养基对大赖草花药培养的试验结果表明 ,C1 7的诱导效果优于 W1 4 。

利用荧光原位杂交技术检测导入普通小麦的大赖草染色质

利用以大赖草基因组DNA为探针的荧光原位杂交技术对导入普通小麦的大赖草染色质进行检测，结果：（1）根尖体细胞或花粉母细胞时期均可用于检测大赖草染色质。间期核中杂交信号点数与所含大赖草染色体数目之间的对应关系依染色体显强C-带末端数不同而不同；（2）利用荧光原位杂交，从普通小麦-大赖草单体异附加系的减数分裂前植株60Co-γ射线辐射后代中检测到一批大赖草端着丝粒染色体和小麦-大赖草染色体易位等结构变异；（3）用基因组原位杂交检测导入小麦的大赖草染色质时加或不加封阻DNA对原位杂交结果无太大影响。

将大赖草种质转移给普通小麦的研究 Ⅴ.三个普通小麦-大赖草二体异附加系的选育与鉴定

利用形态特征的观察、根尖细胞有丝分裂中期染色体计数、花粉母细胞减数分裂中期Ｉ（ＰＭＣＭⅠ）染色体构型分析以及Ｃ－分带，从普通小麦与大赖草（ＬｅｙｍｕｓｒａｃｅｍｏｓｕｓＬａｍ）杂种回交后代中选育出３个二体异附加系：９５Ｇ０４，９５Ｇ１６和９５Ｇ２３，其ＰＭＣＭⅠ染色体配对构型分别为０．１６Ⅰ＋２０．２５○Ⅱ＋１．６７Ⅱ，０．３５Ⅰ＋１８．９５○Ⅱ＋２．８７Ⅱ和０．１９Ⅰ＋２０．０７○Ⅱ＋１．８３Ⅱ。染色体Ｃ－分带结果表明：９５Ｇ０４，９５Ｇ１６，９５Ｇ２３分别为大赖草第１号，第４号。